尼古丁，俗称烟碱，是烟草生物碱的主要成分，也是烟草生产废弃物中的主要有害物质，对人体呼吸系统和交感神经具有潜在的危害。利用微生物降低烟叶烟碱含量和消除烟碱污染是一项具有广阔研究和开发前景的课题。然而，尼古丁降解微生物资源的匮乏和尼古丁代谢机制研究的滞后，严重制约了尼古丁微生物降解的开发和应用。本研究在系统调查和比较烟草根围、烟草内生尼古丁降解细菌多样性的基础上，对其中重要的假单胞杆菌尼古丁代谢相关基因进行了克隆和功能分析。本论文所获得的主要结果如下：　　 1)以尼古丁为唯一碳源，分别从烟草根围和烟草叶片内分离到56和40株尼古丁降解细菌。内生降碱细菌中，19株(47.5％)细菌降解效率超过90％。根围降碱细菌中，39株(69.6％)细菌降解效率超过90％。内生降碱细菌中，40个菌株分布在10个属内，其中Pseudomonas spp.是优势种群，占62.5％。根围降碱细菌中，56个菌株分布在6个属内，其中Arthrobacter spp.是优势种群，占60.7％。烟草内生降碱细菌比根围降碱细菌的丰富度高，同时多样性系数和优势度也高。而根围降碱细菌具有较高的均匀度。本研究首次从Ensifer、Sinorhizobium、Sphingomonas、 Massilia、 Erwinia、 Brevundimonas、Paenibacillus、Cellulosimicrobium属中分离到具有降解尼古丁功能的细菌。　　 2)从筛选菌株中选取了降解能力较强的J5和N7菌株对其分类地位和降解能力进行了深入研究。通过形态观察、生理生化特征分析以及16S rDNA系统发育分析，将菌株J5和N7分别鉴定为Pseudomonas putida和Ensifer sp.。J5菌株在24 h能够完全降解3.0 g/L的尼古丁，最适生长尼古丁浓度为2.0 g/L；N7菌株在24 h能够完全降解2.0 g/L的尼古丁，最适生长尼古丁浓度为2.0 g/L。J5、N7菌株的生长和降解均呈线性关系。分别用108cfu/ml的J5和N7发酵液处理烟草叶片，尼古丁含量降低了11.7％和16.0％，由此说明利用J5和N7可以降低烟草中的尼古丁含量，具有应用和开发潜力。　　 3)利用Tn5转座技术，构建了J5菌株的随机突变体库，并从16324个转化子中筛选到28个完全丧失尼古丁降解能力的突变体。这28个突变体均为单拷贝插入，利用鸟枪法克隆了所有突变体的突变位点基因。对28个突变体的克隆序列进行分析，可以将其分为6类：Ⅰ为氧化还原酶类；Ⅱ为蛋白或金属离子转运系统；Ⅲ为蛋白酶或肽酶类；Ⅳ为转录或翻译调控因子；Ⅴ为未知功能蛋白;Ⅵ类转座子插入在了两个基因的间隔区。其中M728、M430和M9502均突变在钼离子转运系统(ModABC)组成基因上。而节杆菌代谢尼古丁的第一个催化酶就具有严格的钼离子依赖特性。M2022突变位点与节杆菌的6-羟基-L-尼古丁氧化酶(6HLNO)同源性为33％。6HLNO是节杆菌第二个尼古丁催化酶，负责6-羟基-L-尼古丁的氧化。M10突变位点与大肠杆菌的酮泛酸羟甲基转移酶(PanB)同源。对这些基因的进一步研究有助于了解尼古丁在假单杆菌中的转化和代谢。　　 4)根据M10的插入位点序列，克隆了突变位点panB基因全长。该基因全长798 bp，编码265个氨基酸的肽链，与E.coli酮泛酸羟甲基转移酶(PanB)同源性达54％。利用同源重组对J5菌株的panB基因进行了定位敲除，突变体J5△B丧失了对尼古丁、丙酮酸和酮异戊酸的利用能力，而经过基因互补后能够恢复到野生水平。PanB是泛酸合成途径的关键酶，负责从酮异戊酸合成酮泛解酸，而丙酮酸是泛酸合成的直接前体。假单胞杆菌可以将尼古丁代谢为2,5-二羟基吡啶，而2,5-二羟基吡啶可以进一步转化为丁烯二酸和丙酮酸。由此推测，在J5菌株中尼古丁经过一系列酶促降解后参与了泛酸和CoA的合成，为生理代谢提供基质。　　 论文对尼古丁微生物降解资源的调查研究不但具有重要的科学意义，还将为开发新的降解菌株，获得自主知识产权奠定基础。对假单胞杆菌尼古丁代谢相关基因的鉴定和分析是对尼古丁代谢途径、降解关键酶及分子生物学研究的有益补充，为更加充分和合理的利用微生物资源提供理论支持。