论文部分内容阅读
【目的】1、利用表达TSHR-A亚单位的重组腺病毒（Ad-TSHR-289）建立Graves病雌性小鼠模型，并使其受孕至分娩；2、检测新生鼠及子鼠甲状腺形态学、功能及相关抗体的变化；3、检测哺乳期母鼠乳汁中甲状腺自身抗体水平及对子鼠甲状腺形态学和功能的影响。【方法】实验一：(1)Ad-TSHR-289及相关对照组用重组腺病毒扩增：①重组腺病毒的小量扩增；②重组腺病毒的大量扩增；③腺病毒的纯化；④纯化病毒的滴度测定及检测；⑤病毒存放和使用。（2）Balb/c雌性小鼠免疫：分别将Ad-TSHR-289和Ad-β-gal腿部肌肉注射免疫Balb/c雌性小鼠，共免疫三次，每次间隔三周。（3）标本的采集：Balb/c雌性小鼠第二次免疫后一周内眦静脉取血；第三次免疫后第四周眼球取血并处死，并用显微分离技术提取Balb/c小鼠甲状腺。（4）相关抗体及甲状腺素的检测：利用放射免疫分析法（RIA）测定甲状腺素（T4）、利用电化学发光法（ECLIA）测定促甲状腺素受体抗体（TRAb）。（5）甲状腺组织形态学观察：利用HE染色，光镜观察各时期Balb/c小鼠甲状腺形态学变化。实验二：（1）（2）同实验一，（3）将已免疫的Balb/c雌性小鼠与同龄雄性Balb/c小鼠配对，妊娠至分娩。（4）标本采集：Balb/c雌性小鼠免疫第三次后内眦静脉取血，妊娠分娩后分别眼球取血处死Balb/c母鼠及其1d新生鼠、1w新生鼠和3w新生鼠，并取子鼠胃囊内乳块，离心取上清液。用显微分离技术提取Balb/c小鼠甲状腺组织。（6）相关抗体及甲状腺素的检测：利用电化学发光法（ECLIA）测定TRAb、TPOAb和TGAb；利用放射免疫分析法（RIA）测定T4。（7）甲状腺组织形态学观察：利用HE染色，光镜观察各时期Balb/c小鼠甲状腺形态学变化。【结果】实验一：1、扩增纯化后的重组腺病毒带有目的基因：TSHR-289，其大小约800bps。2、实验组中有7只小鼠发生甲亢，发病率为70%。血清T4水平较对照组有显著性增高(P<0.05)；血清TRAb水平较对照组有显著性增高，且均大于0.3IU/L；甲状腺大体标本示实验组小鼠甲状腺体积较对照组明显增大，病理切片示：实验组甲状腺组织增生，部分有淋巴细胞浸润。实验二：1、分娩后1d、1w、3w时Graves病母鼠血清T4、TRAb、TPOAb、TGAb水平均较对照组明显增高，分别有22、18、23只Balb/c母鼠发生甲亢，发病率分别为73.3%、60%、76.67%。2、分娩后1d的母鼠乳清中，9只测得TRAb值，有15只TPOAb>0.5IU/L，有4只测得TGAb值；分娩后1w的子鼠中，有4只测得TRAb值，7只测得TPOAb值，1只测得TGAb值；分娩后3w的母鼠乳清中，TRAb值均小于0.3IU/L，有2只测得TPOAb值，3只测得TGAb值。其中，分娩后1d时实验组乳清中TPOAb较对照组有显著性增高。3、子鼠1w、3w时，分别有114、129只Balb/c小鼠发生甲亢，发病率分别为63.3%、71.7%。实验组中血清T4、TRAb、TPOAb、TGAb水平均较对照组显著性增高。【结论】1、利用表达TSHR A亚单位的重组腺病毒免疫Balb/c小鼠，可成功建立Graves病小鼠模型；2、分娩后Graves病母鼠血清TPOAb及TGAb水平升高可能与TRAb有关；3、母亲乳汁中可含有甲状腺自身抗体，其哺乳时可通过乳汁影响子代的甲状腺功能；4、母亲乳汁中甲状腺自身抗体随着时间的延长而减少；5、母亲甲状腺自身抗体可通过胎盘影响子鼠的甲状腺功能，其体内抗体滴度与对应子鼠的抗体滴度呈正相关。