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研究背景：阿特拉津（ATR）是一种选择性内传导型的除草剂，适用于去除玉米、高梁、甘蔗、果园和茶园内的杂草，主要可防除一年生禾本科杂草以及阔叶杂草，同时对某些多年生杂草也具有一定的抑制作用。2005年，吉林省东辽河流域的旱田及非旱田水域中，ATR的平均值分别9.70μg/L和8.85μg/L。ATR难降解，可致畸变、突变和癌症，其进入土壤和河流后很难被微生物分解，因而在环境中不断蓄积，极大威胁人类健康和生态平衡。ATR的特点是使用量大、残留期长、污染范围广。相关实验研究发现，ATR可使仓鼠染色体发生断裂，影响精子成熟过程，从而影响鼠的正常繁殖；以ATR处理小鼠，小鼠血液中白细胞减少，免疫系统发生异常，并发生肌肉痉挛；以ATR处理体外培养的人淋巴细胞，当ATR浓度为1×10-3μg/L时，可使核染色体发生轻微损坏，而ATR达到5×10-3μg/L时，染色体损伤显著。研究证实，ATR有致癌作用，长期暴露于ATR的实验动物可发生卵巢癌及乳腺癌。Su等的研究表明，ATR可作用于体内CYP19酶，改变其活性，继而干扰内分泌平衡，诱发癌症。关于ATR诱发肿瘤的机制，有报道称是由于ATR产生过氧化反应，导致正常细胞的氧化应激水平增加，由于细胞内氧自由基增加，导致线粒体和细胞核发生DNA损伤，继而正常细胞发生恶变，癌基因被激活。另外，ATR还具有其他生物学毒性，如生殖系统毒性、神经系统毒性、内分泌系统毒性和免疫系统毒性。肝癌是一种恶性程度高、具有高转移性的肿瘤，原发性肝癌是全世界最常见恶性肿瘤之一，其死亡率在胃癌、食道癌之后，位居恶性肿瘤的第三位。我国是原发性肝细胞癌的高发区，每年死于肝癌的人数约占全世界肝癌死亡人数的50%。近20年来，虽然我国的肝癌治疗水平取得了长足进步，但肝癌的发病率和死亡率仍位于癌症的第二位。肝癌的发病原因较多，其中环境因素诱发的肝细胞恶变较为常见，主要是由于环境中的危险因子长期作用，刺激肿瘤的发生，如酒精和香烟等刺激可诱发肝炎，肝炎的长期作用易诱发肝癌。除草剂ATR作为肿瘤的危险分子，可能与肝癌的发生发展有关，其依据是：ATR难于降解并难于被土壤中的微生物所分解，因此导致农作物中的大量残留，未降解的ATR和作物中残留的ATR可被人体吸收并长期蓄积，造成肝脏负担加重，促进病变，继而可能导致肝细胞发生癌变。环境剂量的阿特拉津对肝癌细胞增殖、侵袭的影响尚未见报道。本研究主要探索ATR对肝癌细胞增殖及侵袭能力的影响，并探讨其机制，为农药ATR的正确使用及有效预防ATR的致瘤毒性提供实验基础，进而为ATR的环境预警与临床防治其生物毒性提供理论依据。目的：通过体内外实验，观察除草剂阿特拉津对肝癌细胞H22增殖、侵袭和迁移能力的影响，并探讨其作用机制。方法：选择鼠源性、恶性度高的肝腹水瘤H22细胞作为研究对象，构建小鼠肝原位移植瘤模型。将H22细胞或肝原位移植瘤模型小鼠分别暴露于不同浓度ATR，应用MTT法检测H22细胞的增殖能力，观察移植瘤的体积；应用免疫组化方法检测核增殖抗原PCNA的表达；应用流式细胞仪检测细胞周期，应用Real time PCR，Western blot方法检测周期相关基因P21、P53和Cyclin D1的转录和表达，分析ATR影响细胞周期的机制；应用Real time PCR， Western blot方法检测MMP9、MMP2及VEGF的表达，分析ATR影响细胞侵袭的机制；应用Western blot和Real time PCR检测STAT3信号通路及其下游基因C-myc的表达，分析ATR影响肿瘤细胞和原位移植瘤的信号通路。并利用免疫组化方法进一步验证上述基因和蛋白的表达及定位。结果：0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L的ATR作用H22细胞48h后，MTT结果显示ATR可促进肝癌细胞增殖，流式细胞仪检测结果显示ATR可促进细胞通过G0-G1期检查点，增加S期细胞的比率。成功构建肝脏原位移植瘤C57BL/6动物模型，给予20mg/kg和100mg/kg ATR灌胃处理小鼠后，小鼠肝脏原位移植瘤体积和重量增加，65%的肝脏原位移植瘤转移为腹水瘤，免疫组化结果显示细胞核中PCNA表达上调。体内外实验提示ATR可能通过下调肝癌细胞P53和P21基因的转录与表达，上调肝癌细胞Cyclin D1基因的转录和表达，促进细胞周期的进程。ATR作用后细胞的侵袭能力增强，肝脏原位移植瘤向腹水瘤转移的百分率增加，该作用可能是通过上调MMP2、MMP9和VEGF表达而实现的。而上述作用可能是通过ATR上调STAT3的表达，从而增加下游基因C-myc的表达。结论：ATR可促进肝癌腹水瘤H22细胞的增殖、侵袭和迁移，并增加肝癌H22细胞存活率；促进原位移植瘤生长，增加原位肿瘤的重量，加速肝脏原位移植瘤向腹水瘤的转移。ATR促进肝癌生长转移的作用机制可能是通过调节P21、 P53及Cyclin D1的表达，促进细胞周期进程，从而促进细胞的增殖；通过上调MMP2、MMP9和VEGF表达，促进H22细胞及其原位移植瘤的侵袭和转移，并促进新生血管形成。上述改变可能是通过激活STAT3信号通路及其下游基因C-myc而实现的。