【摘 要】
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目的:炎症反应失控是脓毒症相关肺损伤的典型特征。Caspase-1依赖性的肺泡巨噬细胞（AMs）焦亡是肺损伤进展的关键。同样地,活化的中性粒细胞释放中性粒细胞胞外捕获网（NETs）参与先天免疫反应。并且,NETs和肺泡巨噬细胞都可以参与炎症性疾病的发展。然而,NETs活化肺泡巨噬细胞,维持肺部炎症的具体机制尚不明确。本研究旨在阐明NETs在蛋白翻译后水平激活肺泡巨噬细胞并维持肺损伤进展的具体机制。
【基金项目】
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国家自然科学基金（项目批准号:82160363）
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目的:炎症反应失控是脓毒症相关肺损伤的典型特征。Caspase-1依赖性的肺泡巨噬细胞（AMs）焦亡是肺损伤进展的关键。同样地,活化的中性粒细胞释放中性粒细胞胞外捕获网（NETs）参与先天免疫反应。并且,NETs和肺泡巨噬细胞都可以参与炎症性疾病的发展。然而,NETs活化肺泡巨噬细胞,维持肺部炎症的具体机制尚不明确。本研究旨在阐明NETs在蛋白翻译后水平激活肺泡巨噬细胞并维持肺损伤进展的具体机制。方法:我们通过盲肠结扎穿刺术建立了脓毒性小鼠模型。采用共聚焦显微镜和酶联免疫吸附试验分别检测假手术（Sham）组、CLP组、DNAseⅠ+CLP组肺组织中NETs和IL-1β的含量;利用Western blot和免疫荧光技术确定NETs对AMs细胞焦亡的影响;免疫组化和Western blot技术检测抑制NETs或靶向NLRP3炎性体的关键成分对肺泡巨噬细胞焦亡和肺损伤的保护作用;免疫荧光分析验证了NETs对巨噬细胞内ROS生成的影响;通过免疫共沉淀技术分别检测了NETs对NLRP3去泛素化的促进作用,以及下调ROS水平对NLRP3与泛素分子结合的影响。结果:1.脓毒症小鼠肺组织中NETs生成和白细胞介素1b（IL-1β）释放都与肺损伤加重相关。且抑制NETs可显著降低血浆和BALF中IL-1β水平。2.免疫组化和免疫荧光染色结果提示脓毒症小鼠肺组织的中性粒细胞和巨噬细胞的浸润量增加,且两者在空间位置彼此相邻。3.免疫荧光法用于鉴定体外诱导的NETs。且ELISA结果进一步提示,NETs诱导LPS预处理的巨噬细胞分泌大量的IL-1β和IL-18。DNAseⅠ可抑制NETs联合LPS诱导的IL-1β和IL-18的释放。4.Western Blot和免疫荧光提示,NETs上调NLRP3的水平,介导AMs中ASC foci生成,NLRP3炎性体组装和Caspase-1激活,进而导致全长Gasdermin D（FH-GSDMD）的N端激活片段执行AMs焦亡。5.免疫组化和Western Blot技术检测发现DNAseⅠ腹腔注射可降低脓毒症小鼠肺组织中NLRP3的和N-GSDMD的表达。同时,H＆E染色发现,腹腔注射DNAseⅠ可缓减CLP诱导的小鼠肺损伤。6.免疫共沉淀提示,NETs可诱导LPS预处理的肺泡巨噬细胞内NLRP3去泛素化。并且,去泛素化酶抑制剂G5可抑制NETs诱导的NLRP3去泛素化。7.Western Blot技术检测发现G5可抑制NETs联合LPS诱导的巨噬细胞内NLRP3和N-GSDMD的表达。同样地,共聚焦显微镜检测发现NETs诱导的ASC foci的生成受到G5的抑制。流式细胞术检测发现,相比于LPS+NETs组,LPS+NETs+G5组中死亡的巨噬细胞的数量显著降低。8.免疫荧光技术检测发现,NETs可以触发LPS预处理的肺泡巨噬细胞中ROS的大量生成。当使用DNAseⅠ降解NETs后,胞质内ROS的水平明显降低。9.免疫共沉淀技术检测发现,ROS清除剂剂NAC可抑制NETs联合LPS诱导的肺泡巨噬细胞中NLRP3去泛素化。10.Western Blot技术检测发现NAC可抑制NETs联合LPS诱导的肺泡巨噬细胞内NLRP3和N-GSDMD的表达。同样地,共聚焦显微镜检测发现NETs诱导的ASC foci的生成受到NAC的抑制。流式细胞术检测发现,相比于LPS+NETs组,LPS+NETs+NAC组中死亡的巨噬细胞的数量显著降低。11.免疫组化技术检测发现,NAC腹腔注射可降低脓毒症小鼠肺组织中NLRP3阳性区域。同时,H＆E染色发现NAC对CLP诱导的小鼠肺损伤具有保护作用。结论:NETs可通过刺激巨噬细胞内大量ROS的产生,从而在蛋白翻译后修饰水平调控NLRP3炎性小体激活和AMs焦亡,并加剧脓毒症肺损伤的进展。
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