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第一部分鱼藤酮对大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12的毒性作用目的:探讨鱼藤酮对多巴胺能细胞的毒性作用及其机制。方法:采用不同浓度鱼藤酮处理PC12细胞24小时,用噻唑蓝比色法检测细胞活性,Hoechst 33258染色观察细胞核形态,流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞内活性氧水平和线粒体膜电位,比色法检测细胞内谷胱甘肽水平,荧光底物酶活性法检测caspase 3活性;此外,采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸预处理30分钟,检测上述指标。结果:与正常组相比,10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L和10μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞24小时后,细胞活力和细胞凋亡率呈剂量依赖性下降(P<0.05),其中1μmol/L组MTT吸光度为正常组的42.1%,凋亡率为41.9%。Hoechst 33258染色可见鱼藤酮组具有不同时期凋亡核特征的细胞。鱼藤酮处理后,除10nmol/L组细胞内DHE荧光强度与正常组无显著差异外(P>0.05),余各组细胞内活性氧水平均增高,线粒体膜电位下降及caspase 3活性增高(P<0.05),其变化程度亦呈药物剂量依赖性。谷胱甘肽水平在10nmol/L、100nmol/L鱼藤酮组分别为正常的144%和117%(P<0.05),1μmol/L和10μmol/L组分别下降15%和42%(P<0.05)。N-乙酰半胱氨酸(500μmol/L和2.5mmol/L)预处理30分钟,可部分抑制1μmol/L鱼藤酮所致的上述效应(P<0.05)。结论:鱼藤酮处理可诱导多巴胺能细胞凋亡,其机制与氧化应激和线粒体膜电位下降有关;而且PC12细胞凋亡率具有鱼藤酮剂量依赖性;采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸预处理,可通过抗氧化应激抑制鱼藤酮的毒性效应,该药物对细胞具有保护作用。第二部分鱼藤酮诱导多巴胺能细胞α-突触核蛋白聚集目的:探讨鱼藤酮对多巴胺能细胞α-突触核蛋白表达和聚集的影响。方法:采用不同浓度鱼藤酮(10nmol/L、100nmol/L和1μmol/L)处理PC12细胞24小时,Western印迹法检测α-突触核蛋白表达水平;免疫荧光共聚焦法观察胞浆内α-突触核蛋白聚集物的形成,及硫磺素S染料染色初步了解聚集物的结构性质。此外,采用N-乙酰半胱氨酸预处理(在鱼藤酮作用前30分钟开始预处理),与1μmol/L鱼藤酮组比较α-突触核蛋白表达水平有无变化,以及该抗氧化剂对α-突触核蛋白聚集物形成的影响。结果:Western印迹法显示,鱼藤酮组胞浆内α-突触核蛋白表达水平较正常组显著升高(P<0.05),而且升高的程度呈剂量依赖性;其中,1μmol/L组采用N-乙酰半胱氨酸(500μmol/L)预处理后,α-突触核蛋白表达水平明显下降(P<0.05),但仍高于正常组(P<0.05)。免疫荧光共聚焦结果显示,正常组细胞胞浆内α-突触核蛋白散在分布,1μmol/L鱼藤酮组可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集物形成,呈硫磺素S染色阴性;采用N-乙酰半胱氨酸(500μmol/L)预处理后,聚集物数量减少,体积缩小。结论:鱼藤酮处理可诱导多巴胺能细胞α-突触核蛋白的表达,促进α-突触核蛋白聚集物的形成;而且上述过程均与氧化应激有关。第三部分鱼藤酮诱导多巴胺能细胞α-突触核蛋白表达上调机制研究目的:探讨鱼藤酮诱导多巴胺能细胞α-突触核蛋白表达上调的机制。方法:采用不同浓度鱼藤酮(10nmol/L、100nmol/L和1μmol/L)处理PC12细胞24小时及N-乙酰半胱氨酸(500μmol/L)预处理30分钟,实时荧光定量PCR法检测细胞内α-突触核蛋白mRNA水平。于1μmol/L鱼藤酮处理的不同时间点(2、6、12、18、24小时),收集细胞,采用荧光底物酶活性法检测20S三种酶水解活性(胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽基谷氨酰基水解酶);同时Western印迹法观察α-突触核蛋白表达与时间的相关性。结果:采用鱼藤酮处理PC12细胞24小时后,α-突触核蛋白mRNA水平较正常组显著升高(P<0.05),升高的程度呈剂量依赖性;1μmol/L鱼藤酮组采用N-乙酰半胱氨酸预处理30分钟,该指标较鱼藤酮组显著下降(P<0.05)。1μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞,于2小时20S蛋白酶体酶水解活性开始显著下降(P<0.05),下降的程度具有时间依赖性;而α-突触核蛋白表达水平于6小时开始升高(P<0.05)。N-乙酰半胱氨酸预处理可部分抑制1μmol/L鱼藤酮诱导的蛋白酶体酶活性损伤(P<0.05)。结论:鱼藤酮可诱导α-突触核蛋白转录水平升高及20S蛋白酶体酶水解活性下降,从而促进α-突触核蛋白表达水平的提高;其机制均与氧化应激有关。第四部分多巴胺介导鱼藤酮的细胞毒性和α-突触核蛋白聚集目的:探讨多巴胺能细胞内多巴胺在鱼藤酮的细胞毒性和α-突触核蛋白聚集过程中的作用。方法:采用鱼藤酮(1μmol/L)处理PC12细胞,噻唑蓝比色法检测细胞活性,流式细胞术检测DHR123荧光强度(即细胞内活性氧水平);Western印迹法检测胞浆内α-突触核蛋白表达;免疫荧光法观察α-突触核蛋白聚集物。并采用多巴胺耗竭剂—利血平预处理3小时,观察上述指标。结果:1μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞24小时,导致细胞活力较正常组显著下降(P<0.05),吸光度为0.730±0.01(正常组为1.112±0.025);利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后再给予鱼藤酮,孵育24小时后,吸光度分别为0.945±0.02和1.06±0.03,细胞活力较鱼藤酮组显著升高(P<0.05)。鱼藤酮处理24小时,过氧化物水平升高至正常组的281%,而利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后,分别降至正常组的248%和232%,与鱼藤酮组比较有显著差异(P<0.05)。鱼藤酮处理后,α-突触核蛋白表达水平显著升高,胞浆内可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集物形成;采用上述浓度利血平预处理,α-突触核蛋白表达水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05),α-突触核蛋白聚集物数量减少。结论:多巴胺介导了鱼藤酮对多巴胺能细胞的毒性作用,并可促进α-突触核蛋白聚集物的形成;对于鱼藤酮选择性损伤多巴胺能细胞的机制具有重要意义。