论文部分内容阅读
目的:
糖尿病，特别是2型糖尿病，是心血管疾病进展的独立危险因素。80％的糖尿病病人死于心血管并发症，平均寿命降低约10年。糖尿病病人体内的oxLDL/β2-GPI复合物，CRP/oxLDL复合物，CRP/oxLDL/β2-GPI复合物水平明显高于正常人，且CRP/oxLDL复合物，CRP/oxLDL/β2-GPI复合物在糖尿病合并动脉粥样硬化病人的血清中明显升高。为了明确复合物对动脉粥样硬化发生发展的影响，拟以CRP/oxLDL复合物，oxLDL/β2-GPI复合物，CRP/oxLDL/β2-GPI复合物干预小鼠巨噬细胞，观察巨噬细胞内总胆固醇的堆积情况并探索其相关作用机制。
方法:
以RAW264.7小鼠巨噬细胞为研究对象，分别给予对照，80ug/ml oxLDL，80ug/ml CRP,80ug/mlβ2-GPI,80ug/ml CRP/oxLDL复合物，80ug/mloxLDL/β2-GPI复合物，80ug/ml CRP/oxLDL/β2-GPI的复合物干预24小时，形态学上通过油红O染色观察巨噬细胞对脂质的吞噬;并通过细胞内总胆固醇试剂盒测定各组细胞内总胆固醇的含量;通过实时定量PCR法检测A类清道夫受体(SRA)，B类清道夫受体(CD36)，B类清道夫受体Ⅰ型(SR-BI)和ATP结合盒转运子A1(ABCA1)这些脂质吞噬相关基因mRNA的表达;Western blot法检测MAPK通路中p38MAPK和ERK的表达。
结果:
1.油红O染色结果:给予oxLDL干预24小时后，oxLDL组中巨噬细胞内红色明显，细胞成泡沫状，表明脂质在细胞内堆积，泡沫细胞模型成功;CRP/oxLDL复合物组，oxLDL/β2-GPI复合物组，CRP/oxLDL/β2-GPI复合物组均有泡沫细胞形成。与oxLDL组比较，CRP/oxLDL组中油红染色红色更加明显，细胞内堆积的脂滴更多;oxLDL/β2-GPI组与oxLDL组相比细胞内的红色明显减少，可见细胞内脂质堆积量减少; CRP/oxLDL/β2-GPI组细胞内的红色与oxLDL组比较变化不明显，脂质堆积量无明显差异，但细胞数有所减少。
2.细胞内总胆固醇试剂盒测量结果:与对照组相比，oxLDL组细胞内总胆固醇明显增加，其含量是对照组的1.99倍(P＜0.01);CRP/oxLDL组、oxLDL/β2-GPI组和CRP/oxLDL/β2-GPI组细胞内总胆固醇的含量分别是对照组的4.3倍(P＜0.01)、1.53倍(P＜0.05)和1.94倍(P＜0.01)。与oxLDL组相比，CRP/oxLDL组细胞内总胆固醇含量是oxLDL组的2.16倍(P＜0.01);oxLDL/β2-GPI组细胞内总胆固醇含量较oxLDL组减少23.5％（P＜0.05）;CRP/oxLDL/β2-GPI组细胞内总胆固醇含量与oxLDL组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。
3.实时定量PCR结果显示:oxLDL组能够促进CD36 mRNA(P＜0.05)的表达和明显降低SR-BI，ABCA1 mRNA（均P＜0.05）的表达;与oxLDL组相比，CRP/oxLDL组进一步促进SRA和CD36 mRNA（均P＜0.05）的表达;oxLDL/β2-GPI组增加了SR-BI，ABCA1 mRNA（P＜0.05）的表达;CRP/oxLDL/β2-GPI组与oxLDL组相比各基因的表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。
4.Western blot结果显示: oxLDL组p38MAPK和ERK的磷酸化水平增加（均P＜0.05）;与oxLDL组相比，CRP/oxLDL组的p38MAPK和ERK的磷酸化表达明显上调，差异有统计学意义（均P＜0.05）;oxLDL/β2-GPI组的p38MAPK的磷酸化有所增加，但是差异无统计学意义(P＞0.05），ERK的磷酸化有所减少，但是差异无统计学意义(P＞0.05）; CRP/oxLDL/β2-GPI组p38MAPK磷酸化水平表达增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，而ERK的磷酸化表达水平，差异无统计学意义（P＞0.05）。
结论:
oxLDL通过促进CD36 mRNA的表达和降低SR-BI，ABCA1 mRNA的表达，导致巨噬细胞内脂质堆积，并且脂质在细胞内的积聚是和MAPK通路相关的;CRP/oxLDL明显促进了SRA和CD36 mRNA的表达，促进了细胞内脂质的聚集，加剧了泡沫细胞的形成，同时促进p38MAPK和ERK的磷酸化水平的表达;oxLDL/β2-GPI通过增加SR-BI，ABCA1 mRNA的表达抑制了巨噬细胞对脂质的吞噬，减少了泡沫细胞的形成，与oxLDL组相比，p38MAPK的表达有所增加，但是差异无统计学意义，ERK的磷酸化水平有所增加，但是差异无统计学意义;CRP/oxLDL/β2-GPI组的脂质吞噬无明显变化，ERK的磷酸化水平无变化，但是p38MAPK磷酸化水平表达增加，推测在动脉粥样硬化的发生发展过程中p38MAPK和ERK均参与其中，但是侧重点有所不同，p38MAPK可能主要涉及炎症的产生，ERK可能主要参与了小鼠巨噬细胞吞噬脂质的过程。