脑肿瘤是致死率最高的人类肿瘤之一,其中IV级胶质瘤胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)为成人最常见的原发性脑肿瘤,其患者的中位生存期仅有15个月左右。胶质膜细胞瘤呈现浸润性生长,可向正常脑组织广泛浸润,导致手术切除困难。其次,GBM对常规的放、化疗具有抵抗性,成为其致死率高和复发率高的重要原因。由于尚未完全阐明其发病机制,目前缺乏针对GBM的有效治疗方法。近年来,肿瘤干细胞的理论指出,胶质瘤中有一部分细胞具有极强的致瘤特性,且具有干细胞的特点,是GBM生长和复发的根源,称之为胶质瘤干细胞(glioma stem cell,GSC)。另外,GSCs还对放、化疗具有抵抗性,因而也是GBM复发的根源。我们的研究包括了GSC的分离培养、GSC标志物的探索,以及探讨影响GSC致瘤性和干细胞特征的分子机制。第一部分:采用手术切除的新鲜组织,利用神经干细胞(neural stem cell, NSC)培养基无血清培养基(serum free medium, SFM)培养出富含GSC的神经球。本课题分离培养了17例原发性脑肿瘤,其中7例形成了神经球样细胞系,并可传至5-20代。在此基础上,我们研究了神经干细胞标记物CD15标记GSC的情况。目前研究GSC的一个关键难题是尚缺乏特异性的GSC标记物。CD133(PROM1)是最早采用的GSC标记物,研究指出CD133~+的胶质瘤细胞富含有GSC。然而近期的研究指出也有部分的GSC呈现CD133~-。因而,进一步寻找GSC的标记物即成为研究GSC的重要课题。分析GSC的特点我们得出,GSC具有正常NSCs的特点,且目前的证据指出GBM起源于NSC。因而,我们提出假说,指出NSC的一些标记物也可用于标记GSC。CD15(SSEA-1/LeX)是常用的NSC标记物,我们此部分的目的即是探讨CD15是否可成为GSC的标记物。我们首先采用免疫组织化学的方法研究了CD15在胶质瘤组织中的表达。结果指出CD15广泛表达于胶质瘤,包括胶质母细胞瘤(GBM)、II和III级星形胶质细胞瘤以及室管膜细胞瘤。其次我们采用免疫磁珠分选出CD15~+的细胞,并比较了CD15~+细胞和CD15~-细胞的干细胞特性,发现,CD15~+细胞较CD15~-细胞具有更强的神经球形成能力。将分选的细胞移植入裸鼠脑内后,104的CD15~+细胞即可形成肿瘤而同样数目的CD15~-细胞则不能形成肿瘤。免疫组化研究指出CD15~+细胞形成的移植瘤与原发性的肿瘤具有相似的免疫组织特性。进一步,我们分选出CD133~-CD15~+细胞,发现CD133~-CD15~+细胞也具有GSC特性,即具有形成神经球以及在免疫缺陷小鼠脑内形成肿瘤的能力,进一步证明CD15可标记出部分CD133~-的GSC。同一时间发表的另一篇文章得到了与我们相似的结论(Cell Stem Cell. 2009 May 8;4(5):440-52)。第二部分:癌基因ZNF217对GSC分化的影响。由于GSC对胶质瘤的致瘤性具有重要作用,因而针对GSC的治疗成为具有希望的治疗靶点。目前研究认为,通过促进GSC分化可抑制胶质瘤的生长,因而研究调节GSC干细胞特性以及分化的内在机制成为研究的一个重要方向。目前对控制GSC分化的分子机制尚知之甚少。本部分研究了新的癌基因ZNF217(锌指蛋白217)对GSC分化的影响。ZNF217在多种肿瘤中高表达,且具有抑制干细胞分化的作用。然而ZNF217在胶质瘤的研究尚未见报道。采用实时定量PCR(quantitative RT~-PCR,qPCR)结果指出ZNF217在胶质瘤中的表达显著高于正常脑组织,且在GBM中的表达显著高于低级别胶质瘤(p<0.001)。对一个分子数据库的分析指出,胶质瘤中ZNF217的表达水平与患者的预后负相关,因而是潜在的治疗靶点。其次,ZNF217在GSC中的表达高于正常NSC以及非GSCs(non-GSCs),且在血清培养集中诱导分化后ZNF217的表达降低。这些结果表明,ZNF217在GSC中的特异性高表达,因而可能对GSC的维持具有重要作用。采用siRNA沉默GSC中ZNF217表达可抑制GSC的生长并促进GSC向成熟的细胞分化。因而ZNF217在GBM中高表达对GSC的生长以及维持具有重要的作用。GSC在胶质瘤中处于一个特殊的缺氧微环境中。研究指出缺氧可增加GSC的致瘤性并增加干细胞的比例。因而,我们进一步探讨ZNF217是否也参与了缺氧调控的GSC致瘤性。采用GSC细胞系和常规的U87细胞系,我们研究指出在缺氧环境下ZNF217表达上调。由于缺氧诱导因子(hypoxia inducilble facors, HIFs)是缺氧环境下发挥作用的重要因子,我们进一步探讨了ZNF217是否受到HIFs的调控。利用qPCR对GBM标本的mRNA检测指出ZNF217表达与HIF1αα以及HIF2α呈正相关(p<0.01)。采用siRNA沉默U87和GSC中HIF1α或者HIF2α的表达,会显著降低ZNF217的表达水平,且HIF1α或者HIF2α沉默后ZNF217在缺氧环境中的上调也受到了抑制。因而ZNF217在缺氧环境中的表达上调受到HIFs的调控。第三部分:干细胞因子LIN28对GSC发生的影响。本部分课题在约翰霍普金斯医学院Charles C. Eberhart实验室完成。LIN28可抑制Let-7 microRNA,后者可抑制K-ras、C-myc、HMGA2等癌基因。LIN28在多种癌组织中高表达,且高表达的肿瘤分化较差、患者预后较差。免疫组织化学结果指出LIN28在部分胶质瘤中过表达,而在正常脑组织中未检测到。采用慢病毒介导的shRNA沉默GSC细胞系JHH-GBM1中的LIN28后,MTT和软琼脂克隆试验结果指出沉默LIN28可显著抑制其生长以及克隆形成能力。其次,将LIN28在另一GBM细胞系JHH-GBM14中过表达可增加其侵袭性以及体内形成肿瘤的能力。因而LIN28对GSC的生长具有重要作用。为进一步探讨GSC的发生机制,我们分析了LIN28在GSC形成中的作用。我们采用了人源性的脑皮层神经干细胞(NSC-Ctx),然后利用慢病毒使其表达GBM中常见的癌基因,包括组成性活性K-RAS(constitutively activated KRAS,CA-KRAS),无活性的p53(dominant negative R248W p53,DN-p53),hTERT以及LIN28(NSC-KRAS/p53/hTERT/LIN28)。作为对照我们同时构建了NSC-GFP,NSC-p53/hTERT以及NSC-p53/hTERT/LIN28。值得注意的是我们试图构建的NSC-p53/hTERT/KRAS细胞无法存活,表明LIN28在NSC表达这些基因的过程这起着重要作用。体外实验表明NSC-KRAS/p53/hTERT/LIN28较正常NSC具有更强的增殖特性。体内结果表明,将NSC-KRAS/p53/hTERT/LIN28注射入裸鼠脑内4-5周即可长出肿瘤,且生长的移植瘤呈现胶质瘤的免疫组织特性,表达Nestin、GFAP、Ki67但不表达synaptophysin。而对照组NSC-GFP、NSC-p53/hTERT以及NSC-p53/hTERT/LIN28在移植入裸鼠脑内6个月后均无肿瘤形成。采用shRNA沉默NSC-KRAS/p53/hTERT/LIN28中的LIN28之后细胞无法继续存活。这些结果表明LIN28对NSC向胶质瘤细胞中的转化中起着重要作用。总结:我们成功分离并鉴定出胶质瘤干细胞,且鉴定出新的GSC标志物CD15。在此基础上,我们探索出ZNF217是调控GSC干细胞和致瘤性的重要癌基因,且其表达受到缺氧环境的影响。最后在探讨GSC发生机制的研究中,我们发现干细胞因子LIN28对胶质瘤的形成具有重要作用。这些结果为进一步理解GBM的形成机制以及研发新的靶点提供了理论依据和实验基础。