军团病主要是由军团菌引起的人、畜共患的急性细菌性呼吸道传染病。病程进展快，病死率高，易暴发流行，老年人和免疫抑制患者易感。军团病易流行的主要原因首先在于军团菌广泛存在于天然水和土壤中，且易在含铁的管道内繁殖，如自来水管、喷泉、容积式电热水器、居民住宅楼顶水箱、空调系统冷却塔水和养鱼池等，人畜因吸入含军团菌的气溶胶而感染；其次，军团菌是一种胞内寄生菌，血清型众多，而军团病又没有特异的临床症状，常被临床医生所忽视，易造成误诊误治，病死率高达25％～50％。军团病目前尚无有效的预防措施。因此，研究广谱、高效、持久的疫苗成为迫切需要。 主要外膜蛋白基因mompS是军团菌的高度保守序列，为各血清型所共有，具有属的特异性，是防止军团菌感染的主要保护性抗原基因。编码鞭毛亚单位蛋白的FlaA基因是军团菌的另一保守序列。已有研究表明mompS与FlaA所编码的蛋白具有良好的免疫原性，可作为DNA疫苗的候选抗原。但采用单一抗原的DNA疫苗免疫原性弱于活疫苗，不易产生交叉免疫，而双价DNA疫苗不仅可增强DNA疫苗的免疫原性，还能刺激机体产生多重免疫保护力。因此，本研究以军团菌双价DNA疫苗为研究方向，以军团菌mompS基因和FlaA基因为研究对象，首次成功构建了军团菌的两种双价DNA疫苗：完全融合的momps/FlaA 基因双价DNA疫苗和通过一段柔性链(Linker)连接的mompS／linker／flaA双价DNA疫苗，同时构建了两种相应的单价DNA疫苗：mompS基因DNA疫苗和flaA基因DNA疫苗，并首次对这两种双价DNA疫苗与两种单价DNA疫苗的免疫原性和免疫保护性进行了初步研究。该研究尚未见国内外报道。本研究为开发安全、高效的军团菌疫苗提供研究基础和科学依据。 本研究共分四个部分： 第一部分：以嗜肺军团菌Lpl型的基因组DNA为模板，通过PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因，将mompS基因和flaA基因分别定向克隆到原核表达载体pucl8和pET32a(+)中，并经IPTG诱导分别表达MOMPS和FlaA蛋白；随后构建mompS／flaA完全融合基因和mompS／linker/flaA基因的原核表达重组质粒，经TPTG分别诱导表达出MOMPS／FIaA和MOMPS／Linker／FlaA融合蛋白。 第二部分：将mompS、flaA、mompS／flaA、mompS／linker/flaA定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建四种真核表达重组质粒pcDNA3．1-mompS，pcDNA3.1-flaA、pcDNA3.1-mompS／flaA 和pcDNA3.1一mompS／linkerl/flaA，用脂质体转染NIH3T3细胞，并用免疫荧光技术分别检测到四种重组质粒的瞬时表达，四种重组质粒稳定转染的阳性细胞克隆分别用Western blot分析，结果显示：四种重组质粒均能表达相应分子量大小的蛋白。 第三部分：将构建的四种重组质粒免疫BALBc小鼠，进行体内免疫原性的研究。检测小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ的分泌量和CTL细胞杀伤活性等指标。结果表明：与pcDNA3.1对照组相比，四种重组质粒均有较好的免疫原性，从刺激小鼠产生抗体滴度的水平上分析，mompS／linker／flaA双价DNA疫苗的抗体滴度高于其它三组重组质粒，而mompS／flαA双价DNA疫苗的细胞免疫水平高于其它三组重组质粒，mompS／linker／flaA双价DNA疫苗的细胞免疫水平高于mompS单基因DNA疫苗和．flαA单基因DNA疫苗，mompS单基因DNA疫苗的细胞免疫水平高于．flαA单基因DNA疫苗。 第四部分：用嗜肺军团菌Lpl型攻击感染经四种重组质粒免疫后的BALB／c小鼠，进行免疫保护性的研究。攻击感染4周后做肺组织军团菌培养，检测带菌量，进行肺组织切片HE染色，观察肺组织病理形态学变化，以此来评价四种DNA疫苗对小鼠的免疫保护性。结果显示：四种DNA疫苗均能对小鼠产生一定的免疫保护效果。