新型可溶性补体抑制分子HCI-3的构建及其真核细胞表达的研究

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补体系统是由补体成份、补体调节蛋白及补体受体等30余种糖蛋白组成的成分复杂、分布广泛的蛋白反应系统。生理情况下,补体系统参与杀灭外来微生物、清除坏死组织,是机体防御感染、维持内环境稳定的重要组成部分。病理情况下,补体系统过度活化产生的大量的炎症物质,将扩大和加剧炎症反应,参与感染性和非感染性休克、缺血再灌注损伤、肾小球肾炎、关节炎、神经炎等疾病的病理生理过程。因此,适时恰当地抑制补体过度激活是减轻炎性病理损伤的有效途径。 由于补体激活是一个多途径、多环节的瀑布式反应过程,其中任何一个环节受阻均可抑制其活化。本研究选择调控补体活化途径中C3/C5转化酶形成和MAC攻膜复合物组装这两个重要的环节,通过对调节C3/C5转化酶的补体调节蛋白MCP(membrane cofactor protein,CD46)和DAF(decay-accelerating factor,CD55),以及调节MAC攻膜复合物组装的CD59分子的结构与功能关系分析,选取它们的功能结构域部分,设计合适的连接方式,构建兼有三分子功能的CD46/CD55/CD59嵌合补体抑制分子,命名为HCI-3(Human Chimeric Complement Inhibitor,HCI-3),利用真核细胞表达系统制备可溶性的HCI-3分子,为进一步开发成有效的新型补体抑制药物,应用于防治全身炎症反应综合症(SIRS)、ARDS、MOF、器官移植超急性排斥反应;以及治疗感染性休克、心、脑及小肠的缺血再灌注损伤等其他炎性疾病奠定基础。 本研究取得以下结果:(1)、以人CD46cDNA、CD55cDNA以及CD59cDNA为模板,用PCR技术扩增得到编码人CD46 SCR2-4结构域、CD55 SCRZ一4结构域及CD59胞外功能结构域及GPI锚固位点的cDNA片段,并在CD46与CD55片段之间、以及CD55与CD59片段之间引入合适的接头(Linker),连接构建T具有信号肤、CD46、CD55、CD59功能结构域及GPI锚固位点的GPI锚固型嵌合补体抑制分子mHCI一3的重组cDNA。克隆构建于BluescriPt一M13克隆载体,DNA测序证实了其阅读框碱基序列完整正确。(2)以GPI锚固型 mHCI一3 cDNA为模板,重新设计引物,去掉前端CD59信号肤和GPI锚固位点,引入限制性酶切位点,通过PcR扩增后克隆构建于psecTagA真核表达载体之上,DNA测序结果证实,得到阅读框完整、连接部位正确的可溶性sHCI一3(soluble HumanChimerie Complement Inhibitor,sHCI一3)真核表达载体sHCI一3/P sec几gA。(3)用脂质体法将sHCI一3/pseeTagA真核表达载体质粒瞬时转染哺乳动物细胞,收集培养上清,通过SDs一PAGE及Westem Blotting进行分子量和免疫学活性的初步鉴定。结果显示,sHCI一3分子在真核细胞内可成功的进行分泌性表达。
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