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研究背景原发性肝细胞癌(HCC)是全球第五位最常见的恶性肿瘤，也是近年来发病率上升最快、病死率最高的肿瘤之一。在我国，HBV的高感染性导致慢性肝病、肝硬化的高发性。据研究报道慢性HBV感染者一生中有10-25%的机率发展为HCC。因此从HBV感染到最终的肝癌，其间为早期诊断和早期发现提供了可能。目前常用的高危人群筛查指标是血清甲胎蛋白（AFP）检测及超声检查。AFP是目前公认的唯一可用于临床HCC高危人群筛选及术后随访的肝癌肿瘤标志物，但临床研究表明其敏感性仅36-64%，特异性为79-91%，有1/3左右的HCC可表现为AFP正常,即使AFP升高者,也不能排除慢性肝病、肝硬化等非恶性肝病。超声检查通常难以发现、确认小于3cm的肿块，且超声医师个体诊断水平的差异对诊断结果有很大影响，上述现状导致HCC难以实现早期发现和早期治疗，患者预后差、5年生存率低、病死率高。因此寻找有效的早期筛查及诊断指标对提高肝癌的整体诊治水平迫在眉睫。循环核酸（cfCNA)是一类存在于血液、尿液、脑脊液等循环系统中的RNA和DNA,目前已有研究证实循环核酸和疾病的发生发展有着密切的关系，通过探测循环核酸可以达到诊断疾病的目的，尤其对于肿瘤，如已有研究证实血清中的MiroRNA可以用作多种疾病的诊断。研究目的分析来源于伴乙肝肝癌组织和癌旁组织中特异性表达的lncRNAs,筛选出癌组织中高表达的lncRNAs分子，通过在正常人、乙肝患者及伴乙肝肝癌患者血清中定量验证筛选出的lncRNAs的表达情况，从而探讨血清中的lncRNAs是否可以作为肝癌早期诊断的标记物。研究方法第一部分：lncRNAs在伴乙肝肝癌组织及癌旁组织中的表达及目的lncRNAs的挑选利用5对伴乙肝肝癌组织及癌旁组织做基因芯片，建立伴乙肝肝癌组织中特异表达的lncRNAs谱（差异倍数＞2倍，P＜0.05）。然后随机挑选其中的5个分子在68对伴乙肝肝癌组织和癌旁组织中验证组织芯片的可靠性，最后从特异性表达的lncRNAs中我们挑选了升高倍数>5倍的lncRNAs作为我们的候选分子，通过150例血清样本（正常血清、乙肝患者血清及伴乙肝肝癌患者血清）的验证，找出血清中存在的，有可能作为早期诊断标记物的lncRNAs作为目标分子。第二部分：回顾性大样本量探索目标分子在血清中的表达情况通过回顾性的、大样本的在正常人血清、乙肝患者血清、伴乙肝肝癌患者血清中验证目标分子的表达情况，探讨目标分子作为伴乙肝肝癌早期诊断标记物的可能性、特异性及敏感性，建立使用目标分子作为伴乙肝肝癌早期诊断标记物的诊断模型。第三部分：前瞻性验证回顾性数据得出的诊断模型的诊断效率应用回顾组建立的诊断模型前瞻性的验证适量样本（正常人血清、乙肝患者血清及伴乙肝肝癌患者血清），从而评估该诊断模型的诊断效率以及应用与临床实践的潜在可能性。研究结果第一部分：基因芯片结果显示伴乙肝肝癌组织和癌旁组织之间存在大量差异表达的lncRNAs。通过在伴乙肝肝癌组织和癌旁组织中随机验证5个lncRNAs分子，结果与芯片结果一致。在差异表达的的lncRNAs中升高倍数（癌组织vs.癌旁组织）>5倍的lncRNAs共有23个，通过在三组血清标本（正常血清、乙肝患者血清及伴乙肝肝癌患者血清）中定量验证这23个lncRNAs分子，经过对PCR产物进行基因测序证实所得产物序列与目标分子序列一致。进一步统计分析显示其中两个分子（lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935）有统计学意义（p<0.05)。因此，我们将lncRNA uc003wbd，lncRNA-AF085935选定为目标分子进行下一步研究。第二部分：通过在三组样本中（正常血清、乙肝患者血清、肝癌患者血清）回顾性验证lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935的表达情况，Real time-PCR结果显示lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935在三组样本中的表达均呈肝癌患者血清>乙肝患者血清>正常血清的趋势，且均有统计学意义，lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935诊断肝癌时ROC曲线下的面积分别为：0.8597,95%可信区间为0.8221~0.8974，0.8702,95%可信区间为0.8309~0.9095。以此结果我们利用logitic回顾模型建立了以lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935为基础的诊断模型：Logit(P=HCC)=-6.859+0.719*uc003wbd+1.804*AF085935，回顾性数据显示该模型具有良好的早期诊断效率，应用此模型区分肝癌患者、乙肝患者及正常人的ROC曲线下面积为：AUC=0.9432，95%可信区间为0.9195~0.9668; Sensitivity:69.63，Specificity:95.88。第三部分：Real time-PCR结果显示，在前瞻性观察的队列中应用以回顾组数据为基础建立的诊断模型具有较好的诊断效率，该模型可以较好的区分肝癌患者、乙肝患者及正常人群（AUC=0.9496，95%可信区间为0.9201~0.9791; Sensitivity:65.57，Specificity:99.17），该模型有可以应用与临床实践的潜在可能。结论1、伴乙肝肝癌组织和癌旁组织中具有特异的lncRNAs表达谱。2、血清中存在肿瘤来源的lncRNAs分子。3、以lncRNA-、lncRNA-为基础建立的肝癌早期诊断模型可以较好的区分伴乙肝肝癌患者、乙肝患者及正常人，该模型有应用与临床实践的潜在可能。本课题创新点及潜在应用价值确定了伴乙肝肝癌组织和癌旁组织中特异性lncRNAs表达谱，为后续研究提供参考资料；发现了肿瘤来源的lncRNAs可以存在于血清中；发现了一个新的伴乙肝肝癌早期诊断的标记物。