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盐胁迫是影响作物生长和产量的主要非生物因素之一。土壤中过高的Na+浓度引起了离子毒害、渗透胁迫和K+/Na+比率失调而使植物新陈代谢紊乱,从而对植物造成很大的伤害。而Na+/H+逆向运输蛋白可以催化Na+和H+的逆向跨膜运输,是植物抵御盐胁迫的主要方式之一,在植物耐盐性方面起着重要的作用。对于植物Na+/H+逆向运输蛋白基因的克隆、表达及功能的分析将对植物耐盐基因工程产生重要意义。
根据不同植物编码液泡膜逆向运输蛋白保守区序列,设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,首次从新疆盐生植物车前(Plantago maritima)中克隆到Na+/H+逆向运输蛋白基因的cDNA全长2464 bp,命名为PmNHX1(GenBank登录号:EU233808),该基因编码区长为1662 bp,编码553个氨基酸,分子量为61.16 kD,等电点为7.22。数据分析结果显示,该蛋白质主要定位于液泡膜上,由12个序列保守的跨膜结构域组成,其中TM3跨膜结构域上存在“LFFIYLLPPI”-氨氯吡嗪咪结合域,并且该位点与Na+有竞争作用。其氨基酸序列与野滨黎AgNHX1(BAB11940),拟南芥AtNHX1(NP_187288),盐角草SeNHX1(AAN08157),水稻OsNHX1(BAA83337),棉花GhNHX1(AAM54141)的Na+/H+逆向运输蛋白同源性分别达到88%、89%、75%、76%、73%。
根据PmNHX1基因全长序列设计特异引物扩增其编码区,并将其克隆到pMD18-Tsimple载体中,经测序确认,保留未发生突变的克隆体,用于构建其植物表达载体pBI121-PmNHX1。冻融法将pBI121-PmNHX1重组质粒导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中,获得工程菌LBA4404-pBI121-PmNHX1。
农杆菌介导法将PmNHX1基因编码区导入本塞姆氏烟草(Nictiana benthamiana),获得卡那霉素抗性植株。PCR、RT-PCR及Southern杂交均证明耐盐基因PmNHX1已整合烟草基因组中并正常转录。转基因烟草膜的相对电导率明显低于对照,说明盐胁迫下转基因烟草的膜结构所受损伤小于对照,转基因烟草具有一定的耐盐性,能在含200mmol·L-1 NaCl的培养基中正常生长,长势明显好于对照。