咸蛋清蛋白酶解制备活性肽及其抗氧化、抗菌活性研究

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本文对咸蛋清酶解工艺条件进行筛选和优化。选用木瓜蛋白酶(PP)和酸性蛋白酶(AP)对咸蛋清进行复合酶解,通过对底物浓度、加酶量、pH值、酶解时间等进行单因素分析,然后展开二次旋转正交试验,得到两种单酶酶解咸蛋清的最佳工艺参数,最后确定两酶复合酶解的最佳方式。木瓜蛋白酶酶解咸蛋清的最佳工艺条件为:底物浓度3%、加酶量5000 U/g、酶解温度50℃、pH5.5、酶解6 h。酸性蛋白酶酶解咸蛋清的最优工艺条件为:底物浓度2%,加酶量5000 U/g,pH3.0,55℃,6 h。两酶复合酶解的最佳方式为:先加木瓜蛋白酶反应4h后灭酶,再加酸性蛋白酶反应2 h,两酶加酶量比例为:PP:AP=3:2。根据酶解液的组成特点,采用离子交换层析、膜过滤、大孔吸附树脂等一系列脱盐方法对咸蛋清酶解液进行脱盐。以脱盐率、蛋白收率以及最终产品含盐量为评价指标。通过G-25葡聚糖凝胶层析法得脱盐率91.64%、蛋白收率86.25%、终产品中含盐量4.25%,该方法脱盐效果良好,但成本高,制备量小。DA201-C大孔吸附树脂法得脱盐率93.74%、蛋白收率75.25%、最终产品含盐量1.83%,该方法脱盐效果比较好。纳滤法得脱盐率92.31%、蛋白收率90.38%、终产品含盐量2.25%、该方法制备量比较大,适用范围广。纳滤法和G-25葡聚糖凝胶层析法联用,最后终产品中盐含量减少到0.17%。酶解液脱盐处理后得到了咸蛋清肽,本试验测定了咸蛋清肽的分子量分布范围、氨基酸组成以及其理化性质。采用G-25葡聚糖凝胶层析法和液相色谱法对咸蛋清肽进行了分子量测定。G-25葡聚糖凝胶层析法的测定结果为:酸性蛋白酶酶解物的分子量范围为3554 Da-1364 Da,木瓜蛋白酶酶解物的分子量小于2151 Da,复合酶解物分子量范围为1785 Da-318 Da。液相色谱法的测定结果为:咸蛋清复合酶解物相对分子质量分布在70 Da-14057 Da之间;其中相对分子质量244 Da-480 Da的肽含量最多,占87.75%。咸蛋清肽中大部分是低分子量寡肽物质。咸蛋清肽中必需氨基酸占总氨基酸含量的42.16%。采用氨基酸比值系数法评价咸蛋清肽氨基酸的营养价值,参照FAO/WHO模式,计算得氨基酸比值系数分SRC为66.6173,参照全鸡蛋模式计算得氨基酸比值系数分SRC为51.7966。咸蛋清肽具有较好的溶解性和起泡性,泡沫稳定性相对较差,其热稳定性、还原糖和氯化钙共处稳定性均较好。本文针对咸蛋清肽的抗氧化功能和抗菌功能分别展开了研究。研究结果表明咸蛋清肽具有较强的羟自由基清除能力和超氧阴离子清除能力。20 mg/mL咸蛋清肽的羟自由基清除率高达70.54%,超氧阴离子清除率高达64.71%。咸蛋清肽分子量2000Da-1000 Da范围的组分抗氧化能力最强,分子量低于200 Da的组分抗氧化能力最弱。三种酶解产物的自由基清除能力强弱为:复合酶解产物>木瓜蛋白酶酶解物>酸性蛋白酶酶解物。咸蛋清肽抗氧化功能的热稳定性较好,对pH值比较敏感。盐的存在会降低咸蛋清肽的自由基清除能力。咸蛋清肽对大肠杆菌、沙门氏菌以及菌金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用,最低抑菌浓度分别为:0.6%、0.4%、0.6%。咸蛋清肽作用于细菌后,观察其微观结构,发现菌体的表面出现坍塌和凹陷状态。分子量在2000 Da-1000 Da范围的肽组分对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用最强,1000 Da。400 Da范围的肽组分对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,分子量低于200 Da的组分抑菌性最弱。在一定浓度下,盐对咸蛋清肽抑菌性有抑制作用。咸蛋清肽的抑菌性高于新鲜鸭蛋清肽,鸭蛋清肽的抑菌性高于鸡蛋清肽,此外,咸蛋清肽抑菌性的热稳定性较好,对pH值比较敏感。
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