前言:胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发肿瘤,占比50%以上,其伴随较高的复发率和死亡率,尤以胶质母细胞瘤（GBM）恶性度最高。当前胶质瘤的标准化治疗方案为手术最大程度切除联合放化疗,但其治疗效果并不尽如人意。传统的胶质瘤临床前研究往往只关注于肿瘤细胞本身,而忽略了肿瘤微环境与胶质瘤细胞间的相互调控,事实上肿瘤细胞与基质细胞或免疫细胞之间均可相互影响相互改造。课题组前期研究发现胶质瘤的肿瘤纯度及免疫反应强度可作为预测胶质瘤患者生存预后的重要指标,亦提示了通过改造胶质瘤微环境从而治疗胶质瘤疗法的巨大潜力。本研究针对胶质瘤微环境中两大非肿瘤细胞组分,基质细胞组分及免疫细胞组分,细化探讨了基质细胞成分中的核心成员脑微血管内皮细胞及免疫微环境中干扰素相关信号标志对胶质瘤微环境的影响及在胶质瘤中的重要临床价值,并期待筛选出相关靶向调控分子,达到改造微环境从而靶向抑制胶质瘤的目的。研究方法:（1）数据库信息与组织标本:相关生物信息学分析所用数据由CGGA、TCGA及GEO等平台获取,我们选取CGGA（Chinese Glioma Genome Atlas）数据平台作为主体分析数据库,选取TCGA（The Cancer Genome Atlas）及GEO（Gene Expression Omnibus）数据平台作为外部验证数据库。分子生物学实验验证所需组织标本在取得患者及家属知情同意的情况下由本单位手术获得,相关实验计划通过本单位伦理委员会审核及批准。（2）生物信息学分析方法:主成分分析（PCA）被用来分析样本在某一功能上的分布特征;通过limma R包进行差异基因筛选;通过DAVID数据库对差异基因进行生物学过程与分子通路解析;基因集富集分析（GSEA）用于对富集出的差异功能及通路进行进一步验证;应用Estimate R包进行肿瘤样本的纯度及免疫评分、基质评分计算;通过MCP Counter及Cibersort R包计算样本中各个非肿瘤细胞组分的相对含量。（3）细胞系研究模型:人脑正常星形胶质细胞NHA、人源胶质瘤细胞系LN229、U87、U251以及脑微血管内皮细胞HBMEC购买自中国科学院上海细胞库。（4）分子生物学实验:应用q PCR、WB、免疫组化及免疫荧光验证分子表达情况;IP及液相色谱质谱技术用于判断与目的蛋白存在结合关系的潜在受体蛋白;应用Transwell实验检测胶质瘤细胞/脑微血管内皮细胞的侵袭及迁移能力;MTS用于测定细胞增殖活力;3D基质胶成管实验检测血管内皮细胞形成新生血管的能力;裸鼠颅内原位成瘤模型用于表型或机制的体内验证。（5）统计学分析:应用方差分析、独立样本t检验及卡方检验判断不同分组的变量之间是否存在差异。通过Kaplan-Meier曲线描绘患者生存状态,并进行Log-rank检验比较不同分组患者之间的生存状态差异。应用Cox回归分析确定影响患者生存预后相关因素或靶点。相关性分析采用Pearson检验完成。使用Graph Pad Prism 7、SPSS20.0及R3.6.1等软件完成上述相关分析。将双尾p值小于0.05界定为差异存在统计学意义的标准。结果:第一部分:CTSD/HIF1A信号轴介导了胶质瘤细胞与脑微血管内皮细胞间的相互作用基于公共的TCGA及CGGA胶质瘤患者数据库,我们进行了一些转录水平的生物信息学分析。我们发现在总的GBM患者中,微血管内皮细胞含量对患者预后的影响并不是十分明显;随后我们将患者划分为低肿瘤纯度及高肿瘤纯度两个亚组,再分别根据内皮细胞含量高低做生存分析,发现在高肿瘤纯度组中内皮细胞含量同生存显著相关,即高纯度患者中,血管密度越高提示患者生存预后越差。这一现象很好地说明了当胶质瘤细胞同血管内皮细胞同时高丰度存在的情况下,胶质瘤的恶性进展会更迅速,由此我们提出“胶质瘤细胞-血管内皮细胞命运共同体”的概念。这也为我们提供了新的启示:为何传统的针对VEGFA的靶向抗血管药物贝伐单抗远期效果很不理想。一方面可能与其它促血管因子的代偿性升高有关;另一方面可能由于单独靶向内皮细胞的局限性,而导致胶质瘤细胞本身发生代偿从而另辟新径重构血管网络,包括新的血管形成模式“血管拟态”等。筛选微环境中可调控胶质瘤细胞及脑微血管内皮细胞的共性功能分子将为胶质瘤的靶向抗血管治疗提供新的思路。前期的基础实验发现,给予HBMEC不同剂量的贝伐单抗处理后,我们检测了一系列较为经典的促血管生成因子,其中,Cathepsin家族成员CTSD的上调最为明显;而给予胶质瘤细胞贝伐单抗处理后,促血管生成因子变化均不明显;通过数据库资料及PCR结果分析,发现CTSD亦是为数不多的在胶质瘤细胞及血管内皮细胞中同时高表达的靶点分子;实验证明CTSD可影响胶质瘤细胞的增殖侵袭迁移等表型;CTSD可影响HBMEC的增殖迁移及血管形成能力;生物信息学分析提示CTSD与促血管相关通路激活密切相关,IP-质谱分析筛选到HIF1A可作为CTSD的结合蛋白,并通过实验证实CTSD可结合HIF1A并维持其稳定性上调其表达水平从而激活HIF1A-VEGFA信号轴;我们同时也开展了CTSD特异性抑制剂Pepstatin-A的相关体内外实验,并取得了一定的效果。第二部分:异常激活的干扰素信号及其反应性蛋白IFI30是判断GBM预后及不良免疫微环境组分的重要标志课题组前期结果发现过度的免疫反应和紊乱的免疫微环境是导致GBM不良结局和治疗耐药性的重要因素。干扰素作为调节免疫反应最重要的家族之一,其参与激活了抗原呈递细胞并增强了效应T细胞杀伤肿瘤细胞的功能。然而,有证据表明胶质瘤内干扰素信号的异常激活可促进免疫逃逸,并导致GBM免疫调控点治疗抵抗。因此,迫切需要探索干扰素在胶质瘤中的临床价值并建立可靠的分型方法。我们基于五个具有预后意义的干扰素基因构建了干扰素风险评分,其可以反映不同的干扰素状态。生存分析发现高干扰素风险患者的生存时间显著缩短,多因素COX分析表明,我们建立的干扰素风险评分可作为GBM独立的预后评价指标。功能富集分析表明,高风险患者亚群与异常激活的免疫反应及免疫细胞趋化有关。CIBERSORT微环境分析及大量临床样本免疫组化分析发现高风险GBM患者的微环境更趋向于免疫抑制型,特征为M0巨噬细胞和嗜中性粒细胞显著富集,但活化的自然杀伤（NK）细胞和M1型巨噬细胞（促炎症型）的浸润较少。微环境组分的差异可能是高低干扰素风险GBM患者预后存在显著差异的重要原因之一。此外,我们发现IFI30作为固有的γ-IFN诱导基因亦在胶质瘤的恶性进展、化疗抵抗与免疫微环境重构等方面亦可能发挥重要价值。结论:第一部分:在胶质瘤中,CTSD可通过结合HIF1A激活HIF1A-VEGFA信号轴促进胶质瘤细胞恶性增殖侵袭,其亦可通过直接作用或介导胶质瘤细胞旁分泌效应促进血管生成;脑微血管内皮细胞中贝伐单抗靶向VEGFA治疗可能通过激活溶酶体自噬状态反馈性上调CTSD。探讨CTSD在胶质瘤细胞及脑微血管内皮细胞中的共性调控机制,阐明贝伐单抗处理后CTSD反馈性增高的机制,开展CTSD特异性抑制剂Pepstatin-A同贝伐单抗联合靶向的疗法将为胶质瘤的靶向治疗提供新的思路方法,具有一定的临床转化价值。第二部分:我们建立的干扰素风险评分可作为判断GBM患者生存状态的独立预后因素。我们亦发现高干扰素风险的GBM患者亚群伴随过度激活的免疫反应,微环境成分分析发现高风险组GBM免疫微环境更趋复杂,其特征是M0巨噬细胞和嗜中性粒细胞显著富集,但活化的NK细胞和M1型巨噬细胞浸润较少。外源性的γ-IFN刺激可能通过上调IFI30等微环境相关靶点实现对胶质瘤微环境的重塑进而促进GBM的恶性进展及治疗抵抗。