生菜是一种叶用可生食蔬菜,易繁殖、生长周期短。表达于叶片中的重组蛋白可被稳定储存和运输,无需高温处理即可进入消化途径被人体或动物机体有效吸收。这些特性使生菜在口服疫苗等外源蛋白的表达方面独具优势。利用转基因植物表达生产外源蛋白的关键,在于建立高效的宿主植物离体再生系统、转化系统以及外源基因高效表达系统。因此,建立高效的生菜离体再生体系、克隆强效的生菜内源性启动子序列用以构建高效的生菜表达系统,对于提高生菜转基因效率及转基因产物的表达水平具有十分重要的理论与实践意义。实验以基因型不同的美国结球生菜(AJQ)、美国大速生菜(ADS)和香港玻璃生菜(HKG)为材料,以容易获取的成熟叶片取代子叶作为外植体,分析不同植物生长激素作用下,不同基因型和外植体对于生菜通过愈伤诱导途径及直接诱导不定芽途径形成不定芽的影响。研究还通过生物信息学手段设计简并引物、利用PCR技术从生菜基因组中克隆了rbcS基因的启动子序列,并将报告基因GFP编码序列融合在该序列下游,构建成GFP植物表达载体,经由原生质体瞬时表达及农杆菌法转化烟草、生菜外植体,对实验所克隆的rbcS基因启动子序列的功能进行初步探讨。旨在为生菜高效离体再生体系的建立、实现外源基因对生菜的高效转化、提高外源基因在生菜中的表达效率奠定实验基础。实验结果表明：1.生菜离体再生实验中,AJQ为最佳基因型,其愈伤诱导率最高可达94.44%,直接不定芽诱导率可达95%(4.53芽/外植体),ADS次之,HKG最差。4周苗龄的生菜叶片是进行愈伤组织诱导和直接诱导不定芽发生的最佳外植体,而茎段和根不宜用作外植体。在诱导愈伤发生及愈伤继代时,组成为MS+2μmol/L6-BA+0.3μmol/L NAA的培养基效果最佳,而直接诱导不定芽发生的最适培养基组成为MS+2μmol/L6-BA+1μmol/L NAA,组成为1/2MS+0.3μmol/L NAA的培养基则最有利于生菜不定芽诱导生根。另外,在组成为MS+1.5μmol/L kinetin+1μmol/L6-BA+2.5μmol/L NAA的培养基上,也可以获得理想的不定芽诱导结果。2.根据烟草及其他植物中已知rbcS基因及其启动子全序列设计简并引物,利用PCR技术从生菜叶片基因组扩增获得了生菜rbcS基因编码框起始密码子ATG上游长为1046bp的启动子序列(GenBank登录号：JQ741945)。序列分析表明该启动子序列包含植物启动子构成所必需的核心元件和多种特异性调控元件,具有明确的CAAT-box、TATA-box以及参与光应答、热胁迫应答、脱落酸应答、茉莉酸应答、乙烯应答和分生组织激活等多种相关调控元件。序列比对结果显示该启动子序列与菊科、豆科、茄科三种科属多种植物的rbcS基因启动子序列均存在着较高的相似性。3.分别用包含CAAT-box和TATA-box、长381bp的生菜rbcS基因启动子核心序列和长1046bp的生菜rbcS基因启动子全长序列替换pCAMBIA-1302中的CaMV35S启动子序列,构建成分别由生菜rbcS基因启动子的381bp核心序列和1046bp全长序列启动表达的GFP植物表达载体pCAMBIA-381-GFP和pCAMBIA-1046-GFP。通过脂质体转化,实现GFP在生菜原生质体中的瞬时表达,激光共聚焦检测显示两种不同序列构成的生菜rbcS基因启动子序列,均能启动GFP在生菜原生质球中的表达,且表达的GFP具有天然结构,激光共聚焦检测可以观察到绿色荧光。另外,实验通过农杆菌转化法实现了上述表达载体在转基因烟草、生菜植株中的稳定表达。PCR检测、SDS-PAGE电泳检测及激光共聚焦检测表明,与CaMV35S启动子相比,生菜rbcS基因启动子具有叶部表达特异性,且其在叶片部位启动效率比CaMV35S启动子高。仅有rbcS启动子核心区时也能启动GFP表达,但表达效率低于完整启动子,推测生菜rbcS基因启动子序列的完整性对于其功能的发挥是必须的。