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目的:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种高致残率、后果严重的创伤性中枢神经系统疾病。近年来随着交通业、建筑业的不断发展,脊髓损伤的发病率也在不断上升。脊髓损伤造成的感觉运动功能障碍往往是永久性的,给患者和家庭带来巨大的经济和心理负担。因此对脊髓损伤的研究和治疗是医学界迫切要解决的一项重点难题,神经科学界一直在探索各种方法来提高SCI的治疗效果。大量基础实验研究证实组织工程学在SCI治疗中有着广阔的应用前景,组织工程学治疗SCI的基本模式是生物支架+种子细胞。本实验运用3-D打印机制备仿生支架,研究神经分化因子1(neuronal differentiation 1,NeuroD1)过表达对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)生存和分化的影响,探讨3-D仿生支架载NeuroD1修饰的神经干细胞对大鼠脊髓损伤修复的疗效。方法:1取孕14d的SD(Sprague Dawley)大鼠,麻醉消毒后分离胎鼠大脑海马组织,研磨并胰酶消化后离心,计数后分瓶培养,倒置显微镜下观察神经干细胞生长情况。当神经球直径100-150μm时,胰酶消化后计数传代培养。取第三代神经干细胞行Nestin和DAPI免疫荧光染色鉴定其纯度。将第三代神经干细胞消化计数后种植于预铺多聚赖氨酸的培养板中,7 d后行MAP2、GFAP、MBP免疫荧光染色鉴定其分化潜能。取孕14 d SD大鼠的胎鼠脑皮质分离培养神经干细胞,进行NSCs的鉴定和分化研究。2携带NeuroD1基因的逆转录病毒感染神经干细胞,并研究其对神经干细胞生存和分化的影响。3制备硫酸肝素-胶原蛋白水凝胶,采用3-D打印仿生脊髓支架,扫描电镜观察其结构,测量孔隙率,并模拟体液体外降解实验测量p H值和质量变化。实验分为2组,A组取仿生脊髓支架体外与NSCs共培养,B组直接将细胞悬液接种于预涂左旋多聚赖氨酸的24孔培养板上。采用光镜和扫描电镜观察细胞黏附与形态变化,MTT检测细胞活力,免疫荧光染色鉴定NSCs的分化情况。4 3-D打印支架载NeuroD1修饰的神经干细胞修复脊髓损伤的实验研究。本实验分四组,分别为对照组,支架组,支架+NSCs-GFP组,支架+NSCs-NeuroD1组。于1 w、2 w、4 w、6 w、8 w分别进行在体和离体实验评估:功能学恢复评估和形态学恢复评估。结果:1显微镜下可见神经干细胞生长良好,增殖迅速,7 d左右可形成直径150μm左右的神经球,细胞透光度好。第三代神经干细胞经免疫荧光染色,Nestin和DAPI双标率95%以上。分化鉴定试验可见MAP2、GFAP和MBP阳性细胞,可与DAPI双标。2荧光显微镜下,转染细胞发绿光,GFP转染成功。PCR结果显示NeuroD1 m RNA在NSCs-NeuroD1组表达最高,与其它两组有统计学差异(P<0.05)。PCR结果显示MAP2 m RNA在NSCs-NeuroD1组表达最高,与其它两组有统计学差异(P<0.05)。NSCs-NeuroD1组与其它两组相比,神经元突起长度明显增加,有统计学差异(P<0.05)。MTT结果显示NSCs-NeuroD1组细胞增殖水平与其它两组相比有明显增加,差异有统计学差异(P<0.05)。3 3-D打印机成功制备出胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架,扫描电镜显示内部具有纵行排列、平行的微孔结构,通过排水法计算孔隙率为90%;体外降解实验中,支架p H值未发生明显变化,8周左右支架降解完全,符合组织工程支架要求。MTT检测示两组培养1、3、7 dA值比较差异均无统计学意义(P<0.05);光镜观察两组均可见大量神经球分化,神经纤维交织成网状;培养7 dA组扫描电镜观察示细胞黏附于支架上,大量细胞伸出轴突,并且有神经球形成;免疫荧光染色示,两组均可分化为神经元和胶质细胞,定量分析显示A和B组分化率有统计学意义(P<0.05)。4支架+NSCs-NeuroD1组各时间段BBB评分最高,与其它三组相比有统计学差异(P<0.05)。第八周,Tarlov和Rivlin评分,支架+NSCs-NeuroD1评分最高,与其它三组相比有统计学差异(P<0.05)。神经电生理结果表明,支架+NSCs-NeuroD1组运动和感觉潜伏期最短与其它三组相比有统计学差异(P<0.05);支架+NSCs-NeuroD1组运动和感觉振幅最大,与其它三组相比有统计学差异(P<0.05)。免疫荧光染色结果表明,八周时支架+NSCs-NeuroD1组可见GFP阳性细胞,部分分化为神经元,与支架+NSCs-GFP组相比有统计学差异(P<0.05)。结论:1成功建立胚胎SD大鼠神经干细胞原代培养方法,细胞状态好、纯度高。神经干细胞有多样分化潜能,可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,为神经系统损伤修复和退变性疾病的细胞替代治疗提供了实验基础。2过表达NeuroD1可促进神经干细胞向神经元方向分化,能使分化神经元突起长度增加,对神经干细胞增殖有促进作用。3仿生3-D胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架具有良好的生物相容性,能促进NSCs增殖和分化,作为神经组织工程支架具有良好的研究和应用前景。4仿生3-D支架载NeuroD1修饰的神经干细胞能促进脊髓损伤大鼠神经环路的重建,对运动和感觉功能恢复有促进作用。