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β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶,已被广泛应用到酿酒和饲料工业中.国内对β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究还处于初级阶段,天然菌株的产酶量及酶的性能满足不了实际应用.然而,分子生物学、基因工程方法的应用为其提供了契机.现在国内外对β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究集中表现在构建基因工程菌株来提高酶的产量和性能方面.本研究的主要目的就是通过基因工程及分子生物学方法来提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶表达量,改善其酶学特性,为目前生产中的问题提供有效的解决途径.主要研究内容及相应结果如下:
1.天然菌株产酶研究在基础产酶研究的基础上对培养基碳氮源及发酵条件进行优化.结果表明,4﹪复合碳源燕麦粉、麸皮等比单一成分葡萄糖、蔗糖效果好,1﹪天然氮源蛋白胨同样优于无机、有机氮源.利用优化的营养成分组成培养基,150 rpm,pn 5.0-6.0的情况下天然菌株发酵48 h得到最高的产酶量.
2.β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆及其在大肠杆菌Escherichia.coli中表达以 B.licheniformis EGW039基因组DNA为模板扩增获得了编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因648 bp,将它克隆到表达载体pET28a(+),然后转化E.coli BL21(DE3).重组菌经IPTG诱导表达的重组酶N末端带有6个His标签,分子量达28KDa,表达量占总蛋白的60.9﹪,占细胞可溶性蛋白的12.5﹪.重组酶活力分别为1286(1﹪大麦β-葡聚糖为底物)和986(1﹪地衣多糖为底物)U ml<-1>,比活分别为2479(1﹪大麦β-葡聚糖为底物)和1906(1﹪地衣多糖为底物)U mg<-1>.利用Ni<2+>离子亲和层析柱纯化目的蛋白8.74倍,重组酶最适pH和温度分别为5.6,40℃.
3.β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因改造及其在Pichiapastoris GS115中表达对以B.lichenformis基因组DNA为模板进行PCR 扩增获得的编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因进行密码子优化改造,共改变102个碱基,GC含量从43.6﹪下降到41.6﹪.将优化基因M-eg1314连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,重组载体pPIC9K-M-egl314经BglⅡ酶切线性化后电转化P.pastorisGS115,通过筛选得到阳性重组子.重组酶在P.pastors GS115中实现了分泌表达,摇瓶水平上β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力分别为67.9(1﹪大麦β-葡聚糖为底物)和 52.3(1﹪地衣多糖为底物)u ml<-1>,较未进行优化的β-1,3-1,4-葡聚糖酶表达水平(4U ml<-1>)提高了约15倍;7L发酵罐水平上蛋白分泌量达250 mg L<-1>,酶活力达到333.7(1﹪大麦β-葡聚糖为底物)和256.7(1﹪地衣多糖为底物)U ml<-1>,比活为1334.8(1﹪大麦β-葡聚糖为底物)和1026.8(1﹪地衣多糖为底物)Umg<-1>,最高产酶水平比未优化基因高50多倍.
重组酶由于发生糖基化作用分子量高达34KDa,占总分泌蛋白的53.8﹪;最适pH和最适反应温度分别为6.0,45℃;FeSO<,4>,CoCl<,2>,MnSO<,4>对酶有激活作用,CuSO<,4>,EDTA,β-巯基乙醇,CaCl<,2>则对酶有抑制作用;且重组酶表现了严格的底物特异性,作用于大麦β-葡聚糖或地衣多糖的产物对乳酸菌等益生菌的生长有显著促进作用.根据SDS-PAGE电泳和酶的功能性分析证明,优化的重组蛋白已在P.pastoris中实现表达,且热稳定性有所提高.