2个杨树MYB转录因子的克隆与遗传转化

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木质素在细胞壁加厚结构的构成物质中占有重要的地位,是排在纤维素和半纤维素之后的第三大类物质。木质素可以和细构成细胞壁的其他成分交联结合而形成植物细胞的外层加厚结构,在植物抵抗病虫害、细菌、以及各类养分(水、矿质元素、有毒重金属)等胁迫的过程中起到了非常重要的作用。大量的研究证明,在各种胁迫条件发生时木质素会迅速响应,从而导致木质素所占比例显著增加。硼是植物生命活动过程中必不可少的矿质养分,在我国南方的大部分杨树栽培地区土壤硼含量都表现为低于正常水平的现象。课题组前期的研究表明,缺硼条件下的杨树根系木质素含量显著提高,对照和缺硼杨树根系的数字表达谱对比分析,结果显示硼胁迫环境下有大量与木质素形成通路关联的基因发生了差异表达。本研究以前期数字表达谱为基础,通过与拟南芥中木质素调控相关的木质素合成基因进行比较,分析了PtrMYB192、PtrMYB199这两个基因的组成结构,以及蛋白质中各类组成结构,构建了它们的过量表达载体和RNAi抑制载体,并用表达载体进行了两个基因的侵染转化研究工作,主要的工作及实验结果如下:(1)分别在photozome中拟南芥和杨树基因组数据库下载已公布的,木质素形成调节类基因AtMYB58、AtMYB85、AtMYB43、AtMYB63等的氨基酸组成序列,以及前期数字表达谱中差异表达的MYB转录因子的氨基酸序列,构建氨基酸序列系统进化树(bootstrape value>60)结果表明,PtrMYB192与拟南芥AtMYB58、AtMYB63聚集在同一组,并且在进化方面的同源性非常高;PtrMYB199和AtMYB85、AtMYB43聚集在同一组,在进化方面亲缘关系也非常近。进一步对其基因结构分析发现,AtMYB58、AtMYB63 与 PtrMYB192;AtMYB85、AtMYB43 与 PtrMYB199的基因结构,在外显子个数以及外显子大小方面都比较保守。分析其一级结构发现,PtrMYB192和PtrMYB199为稳定蛋白,都表现亲水性。预测分析信号肽结构以及跨膜单元的信息学结果证明,PtrMYB192、PtrMYB199所翻译的蛋白质结构中没有信号肽结构和跨膜单元的可能结构存在。对PtrMYB192、PtrMYB199蛋白质的结构域和功能方面的信息学预测显示,这两个蛋白质中都具有2个MYB类转录调节基因独特的组件,都具有转录调节功能,并且不具有酶的功能。因此,可以推测都属于R2R3型转录因子。预测二级结构表明,在这两个蛋白质中各结构的比例含量从多到少依次为随机卷曲、a螺旋、延伸链和β转角。三级结构预测分析结果表明,AtMYB58与PtrMYB192、AtMYB43与PtrMYB199有相似的结构域,表明这些蛋白质之间可能有着相似的功能。(2)为了阐明了缺硼条件下蛋白质PtrMYB192、PtrMYB199在缺硼条件下在调控木质素合成中的作用,本研究成功克隆了这两个基因的CDS区,并将它们插入了PCAMBIA1302 载体中,命名为 PCAMBIA1302+MYB192、PCAMBIA1302+MYB199超表达载体。该超表达载体以潮霉素(hygromycinB)抗性基因为筛选标记,在多克隆位点Bgl Ⅱ和BstPⅠ处插入目的基因片段,利用PCR富集检验和多克隆位点特异内切酶酶切分析,结果证明目标基因已经正确导入表达框架中,可以用于后期杨树株系转化实验。(3)本研究还构建了 RNAiPCAMBIA1302+MYB192、RNAiPCAMBIA1302+MYB199的干涉表达载体。该表达框结构通过把目标靶基因的正向反向碱基序列插入到发卡结构框架的功能性内含子碱基序列的(int)两侧,使其转录后可以形成发卡结构,然后将发卡结构分别连接到表达载体PCAMBIA1302的多克隆位点NCOI和BstPI之间形成含有发卡结构的RNAi载体RNAiPCAMBIA1302+MYB192、RNAiPCAMBIA1302+ MB199,利用PCR富集检验和双酶切分析,结果证明目标基因片段已经正确导入发卡结构表达框架中,可以用于后期杨树株系转化实验。(4)本研究中用农杆菌GV3101对南林895杨进行侵染转化,主要是把构建好的表达框结构用电击方法导入菌体中,侵染前预先对南林895杨叶盘避光诱导愈伤组织生长72h,侵染之后的叶盘生长在含有Cef和AS的培养平板中,同时放于遮光条件下培养继续生长72 h,把叶片转换到芽选择培养平板上进行抗性芽的筛选生长。一段时间后,把生长健壮的抗性芽分离出来,转移到下一阶段培养基-芽伸长培养基上生长。分离茎秆结实的芽于诱导生根培养条件下生根生长,最后对抗性苗炼苗,PCR富集检测阳性苗。检测结果表明在得到的6株阳性超表达载体转化的阳性苗中转PtrMYB199的植株4株,转PtrMYB192的2株;RNAi干涉载体RNAiPCAMBIA1302+MYB199转化的阳性苗获得1株。以上研究结果不仅从信息学的角度阐明了目的基因的进化结构以及其翻译蛋白质的各类结构组成和性质,为其后续的功能性研究提供了理论基础,而且通过过量表达载体和RNAi干涉载体的构建以及侵染转化株系的获得,为更进一步从生理上研究它们在木质素形成调节中的重要地位准备了材料和奠定了坚实基础。
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