论文部分内容阅读
目的: 全身麻醉药发育期神经毒性是近年来麻醉学界乃至社会广泛关注的热点。动物研究表明，异氟醚可引起出生后6～7天新生鼠海马和前额叶等区域细胞凋亡，损害突触形成，并导致成年后学习记忆等认知功能降低。然而，异氟醚引起上述表现的具体机制仍不清楚。胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor1，IGF-1)通过PI3K/Akt通路和MEK/ERK通路激活核糖体S6蛋白，促进蛋白质合成、细胞生长和细胞存活，并调控树突发育、树突棘发育、突触形成等大脑发育过程。鉴于IGF-1/PI3K/Akt/S6和IGF-1/MEK/ERK/S6通路在大脑发育中的重要性，本课题将研究异氟醚麻醉暴露后该通路的激活状态，以及其在异氟醚所致细胞凋亡、突触形成损害以及成年后学习记忆下降中的角色。 方法: 1.研究异氟醚暴露对发育期神经元IGF-1/PI3K/Akt/S6和IGF-1/MEK/ERK/S6通路活性的影响 将原代培养7天海马神经元或出生后7天新生大鼠暴露于对照混合气或1.5％异氟醚不同时间，采取ELISA、免疫荧光和Western blot法检测S6蛋白磷酸化程度和IGF-1表达。结合PI3K/Akt通路和MEK/ERK通路抑制剂，明确这两条通路在异氟醚介导IGF-1/S6活性表现中的作用。 2.研究IGF-1/PI3K/Akt/S6和IGF-1/MEK/ERK/S6通路在异氟醚介导神经元凋亡中的作用 将原代培养7天海马神经元暴露于对照混合气或1.5％异氟醚3h、6h、12h，活化caspase-3或FITC-AnnexinⅤ法检测神经元凋亡水平。随后，给予外源性IGF-1和PF-4708671分别激活和抑制IGF-1/PI3K/Akt/S6和IGF-1/MEK/ERK/S6通路，研究该通路在异氟醚介导细胞凋亡中的作用。 3.研究IGF-1/PI3K/Akt/S6和IGF-1/MEK/ERK/S6通路在异氟醚介导突触形成损害中的作用 将原代培养10天海马神经元暴露于对照气体或1.5％异氟醚6h、12h、24h，收集细胞，检测兴奋性突触标志蛋白PSD95和抑制性突触标志蛋白G印hyrin表达水平，从而调查异氟醚对兴奋性突触和抑制性突触的影响。然后，给予外源性IGF-1或PF-4708671，观察IGF-1/PI3 K/Akt/S6和IGF-1/MEK/ERK/S6通路在异氟醚介导突触形成表现中的作用。 4.研究IGF-1/PI3K/Akt/S6和IGF-1/MEK/ERK/S6通路在异氟醚介导学习记忆损害中的作用 选取出生后7天新生大鼠作为研究对象，给予1.8ug/g IGF-1 s.c.或75mg/kgPF-4708671 i.p.或生理盐水，30min后吸入对照气体或1.5％异氟醚6h，麻醉暴露结束将各组新生鼠放回鼠笼，第2天和第3天相同时间点继续给予相同剂量IGF-1或PF-4708671或生理盐水。新生鼠成长至47天时，采用Open-field旷场实验检测大鼠运动能力，2天后采用水迷宫实验检测大鼠空间参考学习与记忆能力。 结果: 1.异氟醚剂量依赖式抑制S6蛋白磷酸化，这一抑制作用持续近24h。进一步研究发现，异氟醚抑制大脑海马组织神经元内的S6蛋白活性，尤其是CA3区。同时，我们发现异氟醚抑制IGF-1和IGF-1受体激活，并且IGF-1通过PI3K/Akt通路和MEK/ERK通路降低S6蛋白活性。 2.流式FITC-AnnexinⅤ和活化caspase-3检测均发现，1.5％异氟醚暴露3h不诱发神经元凋亡，而暴露6h和12h则显著增加细胞凋亡水平。PF-4708671使异氟醚诱发细胞凋亡程度加重，而IGF-1可拮抗异氟醚的作用。进一步研究证实，异氟醚麻醉后Bcl-xL/Bad比值明显下降，PF-4708671使之进一步降低，IGF-1则可使之表达上升。 3.异氟醚剂量依赖式抑制PSD95表达，这一作用持续近24h。PF-4708671使PSD95表达进一步下降，而补充外源性IGF-1则可拮抗异氟醚的作用。研究还发现异氟醚、IGF-1和PF-4708671均不影响Gephyrin表达。 4.发育期异氟醚暴露降低成年后空间参考学习记忆能力，PF-4708671进一步加重异氟醚的作用，而IGF-1则可逆转这一趋势。 结论: 1.异氟醚暴露抑制发育期神经元IGF-1/PI3K/Akt/S6和IGF-1/MEK/ERK/S6通路活性； 2.异氟醚抑制IGF-1/PI3K/Akt/S6和IGF-1/MEK/ERK/S6通路活性后，降低Bcl-xL/Bad比值，诱发神经元凋亡； 3.异氟醚通过IGF-1/PI3K/Akt/S6和IGF-1/MEK/ERK/S6通路损害兴奋性突触形成； 4.IGF-1/PI3K/Akt/S6和IGF-1/MEK/ERK/S6通路参与异氟醚介导的成年后空间学习记忆损害。