【摘 要】
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玉米(ZeaMaysL.)秸秆的主要成分是木质素和纤维素。木质素主要沉积在维管植物的细胞壁中,有增强机械耐受强度和疏导水分的作用。由于木质素结构较复杂,在生产中很难被有效利用,对牧草质量、纸张制造及生物燃料生产具有负面效应。因此利用基因工程手段,在分子水平上调节木质素的生物合成,在不影响植物正常生长的前提下,降低木质素的含量或改变其组分具有重要的意义。该文以玉米B73为植物材料,利用RNAi技术,
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玉米(ZeaMaysL.)秸秆的主要成分是木质素和纤维素。木质素主要沉积在维管植物的细胞壁中,有增强机械耐受强度和疏导水分的作用。由于木质素结构较复杂,在生产中很难被有效利用,对牧草质量、纸张制造及生物燃料生产具有负面效应。因此利用基因工程手段,在分子水平上调节木质素的生物合成,在不影响植物正常生长的前提下,降低木质素的含量或改变其组分具有重要的意义。该文以玉米B73为植物材料,利用RNAi技术,围绕木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)的基因,构建干涉表达载体,开展农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化,并对转化植株进行筛选,同时对转CoA基因的植株进行分子检测和木质素含量检测,取得如下主要结果:1、采用改良的CTAB法提取玉米B73的基因组DNA,利用PCR技术克隆得到COMT基因和CoA基因的部分序列,以pUCCRNAi与p1301载体作为中间载体,通过基因工程成功构建含CaMV35S组成型启动子和抗除草剂Bar基因的RNA干涉载体p1301+COA(±)+Bar与p1301+COMT(±)+Bar。2、建立玉米茎尖转化体系,将p1301+COA(±)+Bar干涉表达载体导入玉米自交系郑58中,获得了抗除草剂的含RNA干涉表达载体的转基因植株。3、对T1代PCR检测阳性转基因植株进行RT-PCR分析和秸秆进行Klason木质素及纤维素的测定,结果显示:RNAi降低了ZmCoA基因的表达水平,转基因植株Klason木质素含量与对照相比平均降低了22.44%,纤维素含量与对照相比平均增加了23.33%。4、将转基因株系茎秆冷冻切片分别在100×和200×下观察,发现转基因植株维管鞘的颜色要比野生型的浅,证明抑制内源ZmCoA基因降低了木质素在维管束部位的沉积,是转基因玉米中木质素含量降低的结果。5、通过GC-MS对木质素单体的相对含量进行测定,得到野生型植株中的S/G为0.636,转基因植株中的S/G为0.999,S/G升高,即S-木质素与G-木质素的含量比值增加,有利于木质素的去除。综上所述,本文成功构建了RNA干涉表达载体p1301+COA(±)+Bar与p1301+COMT(±)+Bar,并将p1301+COA(±)+Bar进行玉米遗传转化,获得转基因植株;对含干涉表达载体的转基因玉米植株进行了系统的检测,转基因玉米中不仅降低了木质素的含量,而且改变了木质素的构成,本研究将对培育低木质素玉米和深入了解木质素合成机制奠定基础。
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