广东省猪HEV RNA序列分析及ORF2部分基因的原核表达与纯化

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戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)是引起经粪口传播的传染性急性戊型肝炎的病原体,近年来被认为是一种人兽共患病,在兽医界成为人们关注的焦点。 本研究为了了解广东省猪戊型肝炎的感染情况以及猪源戊型肝炎病毒与人源戊型肝炎病毒的同源性,参考文献及GenBank中的HEV序列设计合成了较为保守的简并引物,应用巢式反转录聚合酶链式反应(RT-nPCR),对广东省规模化猪场采取的粪便样品进行鉴定,随机选取11份阳性病料进行序列测定,并进行基因型分析,结果显示所调查的广东省猪戊型肝炎病毒均为基因Ⅳ型,与人戊型肝炎的代表株T1株的同源性在85.4~92.1%之间,具有较高的同源性。本实验所检测样品110份,其中阳性35份,阳性率为31.8%,而且90~120日龄的仔猪阳性率较高,而30日龄以下的仔猪以及经产母猪未能检测到HEV基因组。 由于目前为止还没有建立一种供HEV体外培养的成熟的细胞系,以及该病毒对外界敏感等生物学特性,使人们对该病还没有满意的诊断方法,本研究扩增了HEV的结构蛋白基因ORF2的部分片段,命名为SZl,将该片段插入到表达载体pTE-32a(+)上,再将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量35 kDa左右处出现新的蛋白条带,Western-Blot分析表明,融合蛋白能够被HEV阳性血清所识别,具有良好的反应原性,初步确定表达蛋白可以用作基因工程诊断抗原。收集诱导表达的菌液,超声破碎菌体,离心后分别收集上清和沉淀,进行SDS-PAGE,结果证明表达产物主要以包涵体形式存在。亲和层析方法纯化表达蛋白,取少量纯化产物进行SDS-PAGE,结果在35 kDa左右处出现清晰单一的特异性蛋白条带,表明表达产物的纯化良好,为进一步研究建立ELISA诊断试剂盒奠定了基础。
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