乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)属嗜肝DNA病毒科,是一种带有包膜的小型环状部分双链(ds)DNA病毒。HBV感染是导致慢性乙型肝炎(CHB)、肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌(HCC)的主要致病因素,对人类的健康造成很大威胁。由于不同基因型和亚型对乙肝患者存在致病性和治疗效果的差异,云南具有独特的地理位置和多民族聚集的地域特征,针对云南少数民族人群开展HBV的分子流行病学研究为乙型肝炎的治疗和控制具有重要意义。此外,近期研究发现HBV Pg RNA是HBV ccc DNA的直接转录产物,能够通过反映HBV ccc DNA的转录活动状态进而反映慢性乙型肝炎病情进展,从而指导临床治疗和判断预后。然而,目前针对HBV pg RNA的检测方法研究较少且该方法还未推广应用到临床。基于此本论文针对云南地区八个少数民族的普通人群进行了HBV流行病学调查并建立了HBV pg RNA的检测方法以及该方法的评价。首先,针对普通人群我们采集了云南地区五个少数民族(佤族、布朗族、哈尼族、纳西族、普米族)共计2696例血浆样本,利用Elisa方法检测发现,HBs Ag总体阳性率为7.6%(204/2696),其中普米族感染率最高为15.4%(58/376)、哈尼族7.6%(37/487)、佤族7.4%(66/896)、布朗族5.4%(25/464)、纳西族4.9%(23/473)。针对204例HBs Ag阳性样本,我们利用HBV S基因进行基因型和亚型分析,结果显示该人群中HBV亚型分布为B2(48.6%)、C1(34.2%)、B4(13.9%)、C2(0.7%)、C5(0.7%)、和4.9%(10例)未确定基因亚型。为了进一步比较不同少数民族中HBV亚型分布差异,我们还收集了206例包括三个民族(傣族、彝族和汉族)乙肝肝病血液样本,经基因亚型分析显示,该人群中HBV亚型分布为B2(29.6%)、C1(29.1%)、C2(23.3%)、B1(0.5%)、B4(0.5%)以及35个未分型样本。经统计分析发现,哈尼族以B2(75%)为主,普米族以B2(38.6%)和C1(43.9%)亚型为主,纳西族以C1(47.1%)亚型为主,彝族以基因型B2(32.69%)和基因型C1占(38.46%)亚型为主,傣族以基因型C1(67.35%)为主,汉族以基因型B2(30.48%)和C2(36.19%)为主。其次,为了进一步分析上述45例未分型样本的基因特征,我们进行了HBV全基因组序列的扩增,其中我们成功获得了39例HBV全基因序列,经序列分析发现8例属于B/C重组,1例B/I重组。7例属于潜在B新亚型,6例属于C型新亚型,其余16例属于不同亚型。为了进一步命名这些新的HBV亚型,基于HBV全基因组序列我们分别进行了HBV遗传距离分析、同源关系进化树分析、基因重组分析、以及特异性氨基酸突变分析,分析发现这些样本符合HBV基因亚型的命名规则,因此我们将它们命名为B10和C17亚型。最后,我们针对HBV Pg RNA5’和3’端序列的特征,分别建立了两种HBV Pg RNA荧光定量PCR检测方法,经特异性、灵敏性、重复性分析发现针对HBV5’端序列建立的Pg RNA的检测方法特异性更好、灵敏度更高。此外,我们选择了40例临床HBV样本就我们建立的HBV Pg RNA检测方法进行评价,结果显示,慢乙肝样本中HBV Pg RNA含量明显高于乙肝肝癌样本,该结果与临床表现相符与相关文献报道一致,该结果表明我们建立的HBV Pg RNA的方法具有潜在的临床应用价值。综上所述,本研究阐明了HBV在云南地区八个民族中基因型和亚型的分布情况并比较了不同民族之间基因型的差异,揭示了云南地区不同民族HBV基因型的复杂性和多样性。同时我们还建立和评价了两种HBV pg RNA荧光定量的检测方法,为今后HBV的研究提供了重要的理论依据,同时也为临床样本的诊断提供了一种更加方便、灵敏的检测方法。