论文部分内容阅读
量子点（Quantum dots，QDs）作为具有潜在应用的纳米材料之一，因独特的荧光特性，在显示器、图像传感和生物医学等领域都具有广泛的应用前景。因此，全面认识和评价其毒性效应和潜在危害至关重要。肝脏是 QDs 进入体内的主要蓄积器官，但 QDs对肝脏的潜在损伤及相关机制尚不清楚。肝脏作为人体物质代谢最旺盛的器官，每个肝脏细胞中含有大量的线粒体，许多肝脏疾病都与线粒体功能障碍有关。目前有关线粒体功能障碍在QDs肝毒性中的作用研究较少，且QDs引起的线粒体损伤机制尚不明确，有待进一步研究。基于此，本课题在CdTe QDs体内肝脏毒性效应研究的基础上，以两种肝细胞为细胞模型，针对其引起的肝细胞毒性及其线粒体功能障碍进行研究，初步探讨线粒体分裂融合和线粒体自噬在CdTe QDs诱导线粒体损伤中的作用。主要研究内容和研究结果如下：
1. 本研究应用电化学工作站水相合成 MPA 包被的 CdTe QDs，通过荧光分光光度计、透射电子显微镜和马尔文激光粒度仪对QDs进行表征。结果表明CdTe QDs在电镜图中呈现出大小相似和分布均匀，平均粒径为2.62±0.37nm；CdTe QDs在生理盐水和完全培养基中的水合粒径为分别为 30.10±8.91 nm 和 31.93±3.92 nm，Zeta 电位分别为-8.63±1.06 mV和-16.62±0.49 mV。
2. 通过ICR小鼠尾静脉注射CdTe QDs 进行染毒，观察CdTe QDs引起小鼠的体重和肝脏系数变化，检测CdTe QDs在小鼠肝脏中的蓄积情况及其引起的肝脏生化指标和病理学变化，并分析氧化应激和凋亡相关蛋白的表达情况。结果表明CdTe QDs对小鼠体重和肝脏系数影响并不显著，肝脏中镉的蓄积量随着染毒剂量的增加而增加（P<0.05）， 10 μmol/kg的CdTe QDs可引起肝功能相关血清生化指标AST的显著升高（P<0.05），并导致肝脏点状坏死和血管周围炎细胞浸润。同时，CdTe QDs 还可引起肝组织的氧化应激和促凋亡蛋白Bax表达升高（P<0.05）。
3. 采用HepG2和L02细胞作为体外模型，研究CdTe QDs对细胞活力、形态、膜完整性、凋亡发生和凋亡相关蛋白表达的影响。在此基础上进一步研究CdTe QDs对细胞内活性氧水平、ATP生成情况、线粒体膜电位、游离的Ca2+水平以及线粒体超微结构的影响。结果发现表明CdTe QDs以浓度依赖性的方式显著降低了细胞活力、增加了细胞内LDH释放和诱导细胞凋亡（P<0.05）。在光镜下发现暴露于较高浓度的CdTe QDs时，细胞数量明显减少，细胞出现破裂，细胞间连接减少。凋亡相关蛋白检测结果显示， CdTe QDs能够显著降低Bcl-2的表达水平，导致线粒体内细胞色素C的释放，进一步引起caspase3前体裂解成剪切的caspase3，从而诱导细胞内源性凋亡。线粒体毒性研究发现细胞内活性氧水平升高，线粒体跨膜电位的下降、游离的 Ca2+水平升高和 ATP 含量降低（P<0.05）。线粒体超微结构观察发现线粒体嵴的破环。
4. 通过共聚焦显微镜观察以及对线粒体分裂融合和线粒体自噬相关蛋白表达进行检测，判断CdTe QDs对线粒体分裂融合和线粒体自噬的影响。在共聚焦显微镜下观察发现CdTe QDs引起细胞线粒体分布明显分散和数量减少。线粒体分裂融合相关蛋白检测结果显示，100μM CdTe QDs能够明显降低线粒体上Drp1的表达（P<0.05），导致线粒体分裂受阻。同时，CdTe QDs还可引起Opa1的表达降低（P<0.05），影响线粒体内膜融合和嵴的形成。PINK1/Parkin 介导的线粒体自噬相关蛋白检测结果显示，100 μM CdTe QDs 可引起线粒体上 Parkin 表达显著降低（P<0.05）。通过对细胞进行 GFP-LC3质粒转染以及对线粒体进行染色，在共聚焦显微镜下观察线粒体自噬，共定位定量结果表明在100μM CdTe QDs处理下线粒体自噬明显减弱（P<0.05）。
综上所述，体内研究发现CdTe QDs进入小鼠机体后能够在肝脏蓄积，并引起肝脏损伤、氧化应激和凋亡蛋白表达异常。体外研究发现CdTe QDs对两种肝细胞及其线粒体均可产生的明显毒性作用。CdTe QDs 能够抑制线粒体分裂和线粒体内膜融合，从而导致线粒体数目的减少和线粒体嵴结构的破坏。高剂量的CdTe QDs能够明显抑制线粒体自噬，影响受损线粒体的清除。本研究阐明了线粒体分裂融合和线粒体自噬在 CdTe QDs诱导的线粒体功能障碍在中的作用，为后续CdTe QDs更为深入的肝毒性机制研究提供参考。
1. 本研究应用电化学工作站水相合成 MPA 包被的 CdTe QDs，通过荧光分光光度计、透射电子显微镜和马尔文激光粒度仪对QDs进行表征。结果表明CdTe QDs在电镜图中呈现出大小相似和分布均匀，平均粒径为2.62±0.37nm；CdTe QDs在生理盐水和完全培养基中的水合粒径为分别为 30.10±8.91 nm 和 31.93±3.92 nm，Zeta 电位分别为-8.63±1.06 mV和-16.62±0.49 mV。
2. 通过ICR小鼠尾静脉注射CdTe QDs 进行染毒，观察CdTe QDs引起小鼠的体重和肝脏系数变化，检测CdTe QDs在小鼠肝脏中的蓄积情况及其引起的肝脏生化指标和病理学变化，并分析氧化应激和凋亡相关蛋白的表达情况。结果表明CdTe QDs对小鼠体重和肝脏系数影响并不显著，肝脏中镉的蓄积量随着染毒剂量的增加而增加（P<0.05）， 10 μmol/kg的CdTe QDs可引起肝功能相关血清生化指标AST的显著升高（P<0.05），并导致肝脏点状坏死和血管周围炎细胞浸润。同时，CdTe QDs 还可引起肝组织的氧化应激和促凋亡蛋白Bax表达升高（P<0.05）。
3. 采用HepG2和L02细胞作为体外模型，研究CdTe QDs对细胞活力、形态、膜完整性、凋亡发生和凋亡相关蛋白表达的影响。在此基础上进一步研究CdTe QDs对细胞内活性氧水平、ATP生成情况、线粒体膜电位、游离的Ca2+水平以及线粒体超微结构的影响。结果发现表明CdTe QDs以浓度依赖性的方式显著降低了细胞活力、增加了细胞内LDH释放和诱导细胞凋亡（P<0.05）。在光镜下发现暴露于较高浓度的CdTe QDs时，细胞数量明显减少，细胞出现破裂，细胞间连接减少。凋亡相关蛋白检测结果显示， CdTe QDs能够显著降低Bcl-2的表达水平，导致线粒体内细胞色素C的释放，进一步引起caspase3前体裂解成剪切的caspase3，从而诱导细胞内源性凋亡。线粒体毒性研究发现细胞内活性氧水平升高，线粒体跨膜电位的下降、游离的 Ca2+水平升高和 ATP 含量降低（P<0.05）。线粒体超微结构观察发现线粒体嵴的破环。
4. 通过共聚焦显微镜观察以及对线粒体分裂融合和线粒体自噬相关蛋白表达进行检测，判断CdTe QDs对线粒体分裂融合和线粒体自噬的影响。在共聚焦显微镜下观察发现CdTe QDs引起细胞线粒体分布明显分散和数量减少。线粒体分裂融合相关蛋白检测结果显示，100μM CdTe QDs能够明显降低线粒体上Drp1的表达（P<0.05），导致线粒体分裂受阻。同时，CdTe QDs还可引起Opa1的表达降低（P<0.05），影响线粒体内膜融合和嵴的形成。PINK1/Parkin 介导的线粒体自噬相关蛋白检测结果显示，100 μM CdTe QDs 可引起线粒体上 Parkin 表达显著降低（P<0.05）。通过对细胞进行 GFP-LC3质粒转染以及对线粒体进行染色，在共聚焦显微镜下观察线粒体自噬，共定位定量结果表明在100μM CdTe QDs处理下线粒体自噬明显减弱（P<0.05）。
综上所述，体内研究发现CdTe QDs进入小鼠机体后能够在肝脏蓄积，并引起肝脏损伤、氧化应激和凋亡蛋白表达异常。体外研究发现CdTe QDs对两种肝细胞及其线粒体均可产生的明显毒性作用。CdTe QDs 能够抑制线粒体分裂和线粒体内膜融合，从而导致线粒体数目的减少和线粒体嵴结构的破坏。高剂量的CdTe QDs能够明显抑制线粒体自噬，影响受损线粒体的清除。本研究阐明了线粒体分裂融合和线粒体自噬在 CdTe QDs诱导的线粒体功能障碍在中的作用，为后续CdTe QDs更为深入的肝毒性机制研究提供参考。