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创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)占全身创伤发生率第2位,但死残率则处于第1位。在我国,每年所造成的直接和间接经济损失高达100亿元以上,已成为严重的社会公害,始终是广大神经科学者不断探索的课题。载脂蛋白E基因(apolipoprotein E, APOE, apoE为其蛋白)有ε2、ε3、ε4三种等位基因,国外研究以及本课题组前期工作显示,ε4携带者对脑损伤的耐受性低,更易出现伤情加重及不良预后。但是,APOE影响脑损伤病情转归的机制尚未阐明。究其根本,apoE通过调节脂质的运转及代谢发挥其神经生物学作用,脂质代谢和炎症反应的密切联系在上世纪50年代就开始受到国外学者的关注,而且APOE本身也能直接促发全身多系统急、慢性炎症反应。炎症反应在TBI后的病理进程中起着重要作用,在修复损伤组织的同时,由炎症介导释放的多种神经毒性物质导致继发性神经损伤。据此我们推测,TBI触发的创伤性炎症反应,以及由炎症反应造成的神经损伤,因APOE基因型的不同而存在差异,APOEε4携带者创伤后炎性损伤程度强于其它两型,因此造成不良预后。本课题以APOE亚型特异性与创伤后炎性损伤的关系作为切入点,构建人源性ε2、ε3、ε4的真核表达载体,分别转染APOE敲除鼠星形胶质细胞(astrocytes, AS),筛选稳定表达细胞株,建立细胞损伤模型,采用Western Blot、逆转录-PCR等技术研究伤后APOE亚型特异性与细胞早期p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)-核因子-kappa B (NF-κB)炎症信号通路表达的关系,探讨APOE影响继发性神经细胞损伤的作用机制。一、人源性APOE基因真核细胞表达载体的构建、鉴定,以及细胞损伤模型的建立人胎脑组织中提取Total RNA后,设计引物扩增APOEε3基因CDS区域,采用定点突变技术,得到APOEε2及APOEε4的突变体,将三种目的基因片段分别亚克隆至真核表达载体pEGFP-N1,构建pEGFP-N1-APOE重组质粒。对重组质粒进行双酶切、PCR和测序验证后,采用融细胞膜类基因转染试剂Trans-EZ将重组质粒转染至APOE敲除鼠星形胶质细胞,并利用划痕致伤建立细胞损伤模型。结果:双酶切、PCR和质粒测序结果证明APOE各等位基因正确地克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,并能在星形胶质细胞中进行融合表达。结论:成功构建了人源性pEGFP-N1-APOE各亚型的真核表达载体,成功转染真核细胞,并建立细胞损伤模型。二、APOE亚型特异性对星形胶质细胞损伤后早期胞内Ca2+浓度及NF-κB表达的影响设置时间点(致伤前、伤后12h、24h、48h、72h),,使用激光共聚焦显微镜(laser confocal scanning microscope, LCSM)观察三型细胞胞内Ca2+荧光强度,籍此比较不同基因型的星形胶质细胞致伤后受损程度。在相同的时间点,利用逆转录-PCR及Western Blot技术观察三种基因型星形胶质细胞NF-κB的表达,籍此比较三种基因型创伤后炎症反应的程度。结果:自伤后24h起,APOEε4型细胞胞内Ca2+荧光强度要显著高于ε2和ε3型(P<0.05);与之对应的是,ε4型星形胶质细胞NF-κB的表达要显著高于其它两种基因型(P<0.05)。结论:APOEε4伤后早期NF-κB的高表达及由此造成的细胞内Ca2+浓度升高显著异于其它两种基因型,这可能是其导致不良预后的原因之一。三、p38MAPK炎症信号通路对不同APOE亚型星形胶质细胞损伤后NF-κB的差异性表达的影响于致伤前、伤后12h、24h、48h、72h,利用逆转录-PCR及Western Blot技术观察三种基因型星形胶质细胞p38MAPK的表达;同时使用p38MAPK特异性抑制剂SB203580,观察抑制前后,三型细胞NF-κB的表达变化,籍此探讨p38MAPK炎性信号通路是否在更上游参与APOE亚型对颅脑创伤的影响。结果:APOEε4型星形胶质细胞p38MAPK的表达要显著强于其它两型;抑制p38MAPK的表达后,三种基因型细胞NF-κB的表达均降低,ε4型与其它两型间的差异不显著(P<0.05)。结论:伤后早期,APOEε4表达p38MAPK的程度高于其它两型,这可能是其参与影响TBI后炎症反应机制之一。