研究背景腹主动脉瘤（Abdominalaorticaneurysm,AAA）是临床中最常见的动脉瘤类型,是一种复杂而致命的血管疾病。AAA主要发生在肾动脉分叉与髂动脉分叉之间,是一种永久性、不可逆性局部扩张的血管疾病。AAA表现特征是腹主动脉异常扩张至其正常段直径的50%以上,或者扩张超过30 mm。目前多项研究表明,与AAA有关的危险因素包括年龄、性别、吸烟、遗传因素、冠心病、高血压和胆固醇水平等。随着动脉瘤直径的不断增大,破裂出血的风险大大增加,但由于患者在主动脉破裂前无症状且破裂后的风险极高,因此阻断AAA的发生及其进展极为重要。目前,AAA缺乏特异性治疗药物,开放性手术是广泛可用的治疗方法,仍然需要广泛的研究来开发安全的疗法,例如能延缓动脉瘤扩张和破裂的新药。AAA发病过程中包含多种病理表现,如细胞外基质（ECM）降解、免疫细胞浸润、炎症反应、氧化应激、血管平滑肌细胞（VSMC）的凋亡、VSMC表型转换等。细胞外基质成分主要由胶原蛋白、蛋白多糖、弹性蛋白和糖蛋白等大分子物质组成,这些分子通过相互连接和交织形成了复杂的网架结构,维持动脉壁张力并保持一定的弹性。其中MMP2（基质金属蛋白酶2）和MMP9在动脉瘤壁中过表达,在动脉瘤病变中具有高度降解胶原的能力,因此,MMP2和MMP9可能在动脉瘤变性过程中起协同作用。VSMC在血管中的位置使其成为启动内侧变性的理想细胞类型,其从中膜到内膜的迁移涉及高度调节的弹性蛋白降解过程。而肥大细胞则是最近在人类AAA病变中发现的另一种炎症细胞类型,除了促炎细胞因子外,许多由肥大细胞产生的物质或酶被认为与AAA的发展有关。另外有研究结果表明,AAA组织中平滑肌细胞的超氧化物水平升高,大量的活性氧（ROS）在细胞内沉积可以激活MMPs,促进ECM降解。现有研究表明,抑制MMPs活性可以抑制AAA的发展,因此MMPs可能是治疗AAA的有效药物靶标。补体C1q/瘤坏死因子相关蛋白9（C1q/TNF-related protein 9,CTRP9）由信号肽,N端的可变区域,56个G-X-Y重复序列的胶原结构和与免疫补体C1q同源的C端球状结构组成。有研究表明,冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）患者中CTRP9的水平显著降低。随着对CTRP9研究的不断深入,发现CTRP9还参与到多种疾病的多种病理生理过程,如抗炎、抗氧化应激、抑制血管损伤后小鼠VSMC增殖和内膜形成、调节糖脂代谢和改善内皮细胞功能等。然而,CTRP9在AAA中的作用及其相关机制尚无报道及研究。所以,探究CTRP9在AAA中的作用及相关分子机制,寻找针对AAA的有效新靶点,对于AAA的预防、诊断和治疗具有重要意义。研究目的1.探究CTRP9是否与腹主动脉瘤的形成有关;2.探究CTRP9作用于腹主动脉瘤的病理生理机制;3.探究CTRP9对腹主动脉血管壁中平滑肌细胞的作用及相关机制。研究方法1.构建敲基因小鼠利用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6背景的小鼠中获取CTRP9基因敲除小鼠,鉴定基因型后将纯合子与纯合子配对繁殖。2.建立腹主动脉瘤动物模型腹膜内注射1%戊巴比妥麻醉后,沿着腹白线做一个约2厘米的切口。将腹主动脉与周围组织剥离,随后将0.5 mol/LCaCl2浸润的棉签覆盖在腹主动脉上,20分钟后取出棉签,用PBS磷酸盐缓冲液浸润的棉签覆盖于同一位置。10分钟后取出,用1 mL注射器吸取0.9%无菌生理盐水反复冲洗腹腔2～3次,随后用外科线将小鼠腹部肌肉及皮肤依次缝合,关闭切口。对照组则用0.9%无菌生理盐水覆盖于腹主动脉,其余操作与上述操作一致。第一部分:随机选取8～10周龄体重为20～25g的雄性WT小鼠,将其分为对照组和AAA 组。第二部分:随机选取8～10周龄体重为20～25g的雄性WT小鼠和CTRP9-/-小鼠,在WT和CTRP9-/-小鼠中分别构建对照组和AAA组。超声成像及测量主动脉最大直径:实验结束后对第二部分的4组小鼠进行血管超声,获取小鼠腹主动脉血管的B-mode图像。随后取材获取小鼠主动脉及各种组织,并测量小鼠腹主动脉最大直径。3.HE染色、Masson染色和VVG染色染色后观察各组小鼠腹主动脉壁的形态学变化。4.免疫组织化学染色检测各组小鼠腹主动脉组织中的CTRP9、F4/80、α-SMA、Mast cell tryptase、MMP2、MMP9和Collagen Ⅰ的相对含量。5.细胞培养将细胞置于DMEM高糖培养基+10%的胎牛血清+100 U/mL青霉素-链霉素培养基中,在37℃和5%CO2的恒温恒湿培养箱中培养。6.建立细胞模型（1）在 VSMC 中按照浓度梯度（0,100nmol/L,500nmol/L,1 μmol/L,2μmol/L）依次加入炎性刺激Ang Ⅱ刺激24小时;（2）在VSMC细胞中转染siCTRP9后,在相应的孔中加入1 μmol/L的Ang Ⅱ处理24 小时,因此将细胞分为 4 组:siNC,siCTRP9,Ang Ⅱ+siNC,Ang Ⅱ+siCTRP9。在VSMC细胞中转染siCTRP9后,在对应的孔中加入AMPK激动剂AICAR预处理1小时,随后加入1 μmol/L Ang Ⅱ处理24小时。7.DCFH-DA 检测 VSMC 中的 ROS在每个孔内加入250 μL按照1:500比例稀释的DCFH-DA溶液,孵育30分钟后用PBS润洗3次,在手动倒置荧光显微镜下观察ROS。8.明胶酶谱实验检测腹主动脉和VSMC中的MMP2和MMP9的活性。9.Western blot检测腹主动脉和 VSMC 中的 CTRP9、MMP2、MMP9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、p-AMPK/total AMPK 和 SIRT1 的表达水平。10.统计分析实验所得数据均使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。统计结果均以均数±标准误（mean±SEM）的形式表示。P＜0.05时,认为差异具有统计学意义。研究结果1.在小鼠AAA模型中CTRP9的表达明显下降免疫组织化学染色和Western blot检测结果显示,与对照组相比,野生型AAA组腹主动脉中CTRP9的表达显著降低。通过免疫荧光双染色检测可知,与对照组相比,野生型AAA组腹主动脉的平滑肌细胞中CTRP9的含量减少。2.CTRP9敲除加重小鼠AAA的发展CTRP9-/-均为纯合子,验证小鼠体内CTRP9已敲除。通过测量腹主动脉直径及血管超声图像可知,与WT AAA组相比,CTRP9-/-AAA组腹主动脉扩张更明显。3.CTRP9敲除加剧主动脉壁的病理变化HE染色、Masson染色和VVG染色观察各组腹主动脉管壁的形态学变化。结果显示,两组对照组腹主动脉的形态无明显差异,WTAAA组腹主动脉明显扩张,中膜破裂,细胞外基质降解明显,弹性纤维丧失其完整性。与WT AAA组相比,CTRP9-/-AAA组腹主动脉扩张更明显,中膜破裂更严重,细胞外基质降解更加明显,明显破坏了弹性纤维的完整性。4.CTRP9敲除促进巨噬细胞、肥大细胞的浸润,降低VSMC的含量通过免疫组织化学染色可知,与WTAAA组相比,CTRP9-/AAA组腹主动脉F4/80和肥大细胞类胰蛋白酶的相对含量明显增加,而α-SMA的相对含量明显降低。5.CTRP9敲除促进细胞外基质的降解通过免疫组织化学染色可知,与WT AAA组相比,CTRP9-/-AAA组腹主动脉MMP2和MMP9的相对含量明显增加,Collagen Ⅰ的相对含量明显下降。提取小鼠腹主动脉组织蛋白,通过Western blot可知,与WT AAA组相比,CTRP9-/-AAA组促进腹主动脉MMP2和MMP9的蛋白表达水平,降低Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的蛋白表达水平。6.在Ang Ⅱ刺激下VSMC中CTRP9的表达降低CTRP9的蛋白表达水平随着Ang Ⅱ浓度的增加而逐渐降低,其中在1 μmol/L AngⅡ浓度下CTRP9的降低最为显著。7.干扰CTRP9促进VSMC中MMP的表达和活性,降低胶原蛋白的表达干扰CTRP9促进VSMC中MMP2和MMP9的表达,增强MMP2和MMP9活性,降低 Collagen Ⅰ 和 Collagen Ⅲ 的表达。siCTRP9 干扰 VSMC 中的 CTRP9,与 Ang Ⅱ相比,Ang Ⅱ+siCTRP9促进ROS的生成,促进MMP2和MMP9的表达,增强MMP2和MMP9的活性,降低Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达。8.CTRP9通过AMPK/SIRT1信号通路调节MMP的表达在体内,与对照组相比,WT AAA组中磷酸化AMPK和SIRT1蛋白表达水平明显下降,而CTRP9-/-AAA组磷酸化AMPK和SIRT1进一步下降。在体外,与AngⅡ相比,Ang Ⅱ+siCTRP9使磷酸化AMPK和SIRT1下降更为显著。加入AICAR后Western blot结果表明,CTRP9通过AMPK/SIRT1信号通路调节MMP2和MMP9的表达。研究结论（1）在野生型小鼠AAA以及炎性刺激下的VSMC中,CTRP9的表达有所下降。（2）体内敲除CTRP9可通过促进炎症反应、平滑肌细胞减少,MMP激活和细胞外基质降解,破坏血管壁平滑肌的收缩特性和完整性来促进AAA的形成。（3）体外干扰CTRP9可促进VSMC中MMP的激活,降低胶原蛋白的生成;（4）CTRP9通过AMPK/SIRT1信号通路调控VSMC中MMP的激活。