目的：　　 肺癌是世界上发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一,刷检和活检相结合是目前临床纤支镜诊断肺癌最常用的方法,但由于细胞量少或受取材限制等原因,其敏感性仍不尽如人意。而发现敏感有效的肺癌标记物则成为临床诊断肺癌的新途径。　　 刷检因简便、快捷、经济、实用且准确性高而成为诊断肺癌的重要方法之一。然而,当癌细胞异型性不明显或数量较少时,临床上经常出现高度可疑为肺癌,反复的细胞学检查却是阴性的结果。这可能是由于玻片中的癌细胞被大量的红细胞、坏死碎屑和大量粘液所掩盖。液基细胞学检测系统(Liquid-based CytologicalTest,LBC)通过祛除标本内的粘液、杂质及炎性细胞,制成视野清晰的薄层涂片,在临床细胞学诊断上已得到了细胞学工作者的一致认可。　　 本课题以肺癌为主攻对象,以纤支镜刷检液基细胞学标本为检测基础,采用RT-PCR方法测定肺良性病变细胞变及癌细胞中HIF-1α mRNA、GLUT1 mRNA及LUNX mRNA的表达;探讨这三种基因的表达与细胞学及组织学诊断结果之间的关系及对诊断肺癌的临床应用价值。　　 方法：　　 收集中国医科大学附属第一医院2009年1月至2010年10月门诊及住院肺癌患者术前纤维支气管镜刷检标本96例。鳞癌58例,腺癌28例,小细胞癌10例,以及肺良性疾病患者91例(包括炎症70例和结核21例)。　　 (一)提取mRNA。　　 1.标本的处理,离心:　　 将支气管镜刷检标本置于离心管,2000r/min,5min离心,弃上清,取沉渣。　　 2.TRIZOL法提取mRNA:RNA可进行mRNA分离,或保存于-70℃冰箱。　　 (二)RT-PCR:　　 1.cDNA第一链合成；　　 2.聚合酶链式反应35个循环；　　 (三)电泳:8％聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染法显色。　　 结果：　　 1.HIF-1α mRNA的表达在肺癌与肺良性病变的差异具有显著性(P＜0.01),在96例肺癌标本中有82例阳性,其中鳞癌(5258)89.7％、腺癌(2128)75％、小细胞癌(910)90.0％　　 2.GLUT1 mRNA的表达在肺癌与肺良性病变的差异具有显著性(P＜0.01),在96例肺癌标本中有93例阳性,其中鳞癌(5858)100％、腺癌(2428)89.3％、小细胞癌(810)80％　　 3.LUNX mRNA的表达在肺癌与肺良性病变的差异具有显著性(P＜0.01),在96例肺癌标本中有90例阳性,其中鳞癌(5858)100％、腺癌(2628)92.9％、小细胞癌(610)60％　　 4.HIF-1α mRNA、GLUT1 mRNA及LUNX mRNA三者的表达在肺癌中存在相关性。　　 讨论：　　 纤支镜刷检因简便、快捷、经济、实用且准确性高而成为诊断肺癌的重要方法之一。然而,当癌细胞异型性不明显或数量较少时,临床上经常出现高度可疑为肺癌,反复的细胞学检查却是阴性的结果。这可能是由于玻片中的癌细胞被大量的红细胞、坏死碎屑和大量粘液所掩盖。液基细胞学检测的优势是涂片背景干净,红细胞大多破坏消失,粘液丝溶解,炎性细胞数量明显减少,异常细胞显而易见不易漏诊。本研究中对187例肺癌标本进行了检测,这三种标记物的敏感性要明显高于细胞学。　　 与传统的细胞学检查相比,LBC可以提供一个更清洁的背景环境,较小的观察区域和保存完好的细胞的原始立体结构。然而,单靠细胞学评价似乎是相对不敏感。这可能是由于取样或判读上的错误或者一些早期病变的可识别表型没有显示改变。因此,有必要找到一种更准确方法检测恶性细胞。最近,我们利用RT-PCR技术在肺癌患者胸腔积液的检测结果证明,这项技术的敏感性要明显高于免疫细胞化学方法。　　 对于肿瘤性疾病,如果在临床上能够确定一个有效的分子标记那对治疗是非常有意义的。RT-PCR是一个敏感性很高的方法,可以准确地在106个细胞中检测出一个癌细胞。在本研究中,HIF-1α mRNA、GLUT1 mRNA及LUNX mRNA的阳性率在在恶性组分别明显高于良性疾病组(P＜0.01);并且在分别利用这三种标记物诊断恶性肿瘤其敏感性都明显高于细胞学方法(P＜0.01)。对于GLUT1有30细胞学诊断的假阴性标本采用RT-PCR方法检测GLUT1 mRNA得到阳性的成果:其中7例中重度异形型增生,4例轻度非典型增生和16例良性病例。研究表明,假阴性细胞学检查结果的原因可能是癌细胞异型性只有轻微的改变或支气管镜刷检标本的细胞量有限。虽然4例细胞学结果是非典型增生标本的组织学是恶性的(并且RT-PCR阳性),但细胞学异型性与恶性肿瘤并无必定的关联即使是RT-PCR检测阳性。在这项研究中有8例假阳性的RT-PCR病例,其敏感性为93.8％,因此,GLUT1 mRNA的表达可以作为一个肺癌诊断敏感的分子标记物,但其特异性要低于细胞学方法。　　 GUJT1的高表达或激活,或两者都有,已被证明与正常细胞和恶性肿瘤之间的转换相关,并且GLUT1的表达是受组织的微环境的变化调节的。在正常组织中GLUT1的高表达葡萄糖代谢利用增加相关,在人类多种肿瘤中都存在这中葡萄糖转运体的过表达。GLUT1的过表达也在像血,缺氧或两者都有的这样的以葡萄糖作为能源的依赖的环境中观察到。这些数据表明在一个非理想的生理环境中度GLUT1表达可能通过维持肿瘤细胞充足的能源供应以支持高代谢率和快速增长率,对于肿瘤细胞的生存起着重要作用。　　 在多种肿瘤中都检测到了GLUT1的表达,包括乳腺癌,头颈部肿瘤,膀胱癌以及肾细胞癌。在肺组织中发现34.3-100％的腺癌和100％鳞状细胞癌都表达GLUT1。并且在原发性肺肿瘤中GLUT1的表达明显高于正常肺组织。在本研究中,无论是大体分型的中心型、周围型还是弥漫型及任一种组织学分型,检测GLUT1mRNA的阳性率都要明显高于液基细胞学方法。　　 HIF-1α是由α和β两个亚基组成的异源性二聚体核转录因子。编码HIF-1α蛋白质的基因在人体定位于14号染色体q14-24区,是惟一的氧调节亚单位。肿瘤的无限增殖和侵袭需要高糖水平来维持。肿瘤的快速增长过程中,形成局部缺氧和糖缺乏的微环境应该是其增长过程中的普遍现象。在缺氧状态下,HIF-1α能通过诱导糖酵解相关酶的表达,使糖酵解活动增加,从而一定程度改善肿瘤缺氧造成供能和耗能之间的失衡状态,HIF-1α可促进肿瘤细胞葡萄糖转运蛋白(glucosetransporter,GLUT)基因的表达,以满足肿瘤生长的能量需求。GLUT1是葡萄糖转运蛋白家族成员之一,主要负责组织细胞的基础糖需求。目前有关肿瘤组织HIF1α与GLUT1表达相关性的研究国外仅有少量报道,国内尚未见报道,本研究采用RT-PCR方法在纤支镜刷检细胞中研究了两者的关系,证明两者肺部恶性肿瘤中存在相关性。在本研究中在对96例肺癌标本的检测表明HIF-1α的表达与GLUT1的表达存在相关性.　　 对于LUNX有30细胞学诊断的假阴性标本采用RT-PCR方法检测LUNXmRNA得到阳性的成果;其中7例中重度异形增生,4例轻度非典型增生和19例良性病例。研究表明,假阴性细胞学检查结果的原因可能是癌细胞异型性只有轻微的改变或支气管镜刷检标本的细胞量有限。虽然4例细胞学结果是重度异形增生标本的组织学是恶性的(并且RT-PCR阳性),但细胞学异型性与恶性肿瘤并无必定的关联即使是RT-PCR检测阳性。在这项研究中有15个假阳性的RT-PCR病例。其敏感性为93.8％。因此,LUNX mRNA的表达可以作为一个肺癌诊断敏感的分子标记物,但其特异性要低于细胞学方法。　　 LUNX,是与腭、肺、鼻腔上皮癌相关的基因也被称为Plunc或SPLUNC1,是一个新的人类肺特异性基因,据报道在淋巴结和外周血中其是检测NSCLC微转移的良好标记物。在非小细胞肺癌LUNX mRNA的表达显着高与相应的癌旁组织。并有学者利用实时RT-PCR技术研究非小细胞肺癌外周血和胸水中指出,在五个基因LUNX,hnRNP,KS1/4,CEA和CK19中LUNX的敏感性是最高的。　　 应用RT-PCR技术检测纤支镜刷检细胞中HIF-1α mRNA、GLUT1 mRNA及LUNX mRNA的表达其敏感性要明显高于细胞学方法,对于临床确诊肺癌病理具有重要意义。　　 结论：　　 1.HIF-1α mRNA、GLUT1 mRNA及LUNX mRNA的表达在肺癌与良性病变之间有明显差异。　　 2.HIF-1α mRNA、GLUT1 mRNA及LUNX mRNA三者的表达在肺癌中存在相关性。　　 3.利用RT-PCR检测HIF-1α mRNA、GLUT1 mRNA及LUNX mRNA的表达在诊断肺癌的敏感性均高于细胞学方法。　　 4.在支气管镜刷检细胞中利用RT-PCR检测HIF-1α mRNA、GLUT1 mRNA及LUNX mRNA表达对早期诊断肺癌有重要意义。