背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)微血管病变所产生的严重并发症之一。糖尿病肾病时,系膜细胞过度增殖并合成大量细胞外基质从而促进肾小球硬化,加快病情进展。系膜细胞改变的原因在于各种功能蛋白表达异常。新近的研究发现,mRNA稳定性对于蛋白表达的调控具有重要意义。HuR是研究最为广泛的可以调节mRNA稳定性的蛋白,主要作用于多种靶基因mRNA 3’UTR的ARE区。现已发现其在肾小球系膜细胞表达,且HuR表达或活性异常与多种炎症因子诱导的系膜细胞形态或者功能改变有关。但HuR在高糖环境下是否对系膜细胞形态与功能有影响尚不清楚。固有免疫系统的激活及后续炎症介质的释放在DN的发生发展中起到了重要作用。固有免疫系统通过模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)来识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMP)。NLR (NOD-like receptors)是PRR中重要的一个亚家族,它可以在多种肾脏疾病中活化免疫细胞和肾脏固有细胞,诱导炎症因子的释放并导致组织损伤。我们实验室最近的研究已经证实,NLR家族中的重要成员NOD2在糖尿病肾病患者肾活检组织标本中表达上调,Nod2基因敲除可明显改善小鼠的糖尿病性肾损伤,但NOD2在高糖条件下表达上调的机制仍然未知。通过基因序列分析,我们发现NOD2 mRNA的3’UTR端中含有潜在的可被HuR识别的ARE序列,且不同物种间高度保守。这强烈提示NOD2可能是HuR的潜在调控靶点。因此,探讨HuR与NOD2转录后调控的关系是本课题拟解决的一个关键问题。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是广泛存在于各种细胞、组织中的一种自由基。以NOX4为主的NADPH氧化酶是肾脏中重要的活性氧来源。已有研究表明,ROS可调控HuR的核质穿梭过程。但NOX4对HuR的作用及其与糖尿病肾病慢性炎症的关系仍不清楚。因此,明确糖尿病肾病状态下NOX4产生的活性氧对HuR的调控及由此造成的固有免疫、炎症因子的改变对糖尿病肾病发病机制的理解具有重要意义。研究目的1.确定HuR在糖尿病肾病中的表达及作用,探讨以HuR为靶点的基因干预对糖尿病肾病的治疗作用。2.明确HuR是否参与NOD2 mRNA稳定性调控及相关机制。3.探讨NOX4介导的氧化应激对HuR及NOD2的调控作用。研究方法1 RNA结合蛋白HuR在糖尿病肾病中的作用及机制1.1 HuR在人肾组织中的表达及其与DN患者蛋白尿的关系从山东大学附属省立医院及山东大学医学院病理学教研室获取正常、糖尿病肾病及糖尿病非肾病组织样本。免疫组化染色观察HuR表达。统计糖尿病肾病患者24h尿蛋白量,分析患者肾组织中HuR表达量与尿蛋白量的相关性。1.2干扰肾皮质HuR表达对大鼠糖尿病肾病的影响大鼠分组及造模：雄性SD大鼠,随机分为正常组,糖尿病肾病组,scramble对照组,shRNA对照组,糖尿病肾病+scramble组,糖尿病肾病+shRNA组。每组10只。采用单肾切除加链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射的方法诱导糖尿病肾病,同时,采用肾实质内注射的方法导入含scramble或shRNA-HuR序列的慢病毒。喂养12周后通过监测空腹血糖、24h尿蛋白量等指标确定糖尿病肾病造模是否成功。免疫组化检测HuR在糖尿病肾病肾皮质中的表达变化。PAS染色观察干扰HuR后对糖尿病肾病肾小球形态的影响,ELISA检测各组大鼠肾皮质炎症因子的变化。1.3高糖刺激对RMC中HuR表达及核质穿梭的影响体外培养大鼠系膜细胞(rat mesangial cell,RMC),使用不同时间及不同浓度梯度的葡萄糖刺激细胞,分别提取细胞质蛋白、细胞核蛋白和总蛋白。Westernblot检测不同细胞组分中HuR表达量。细胞免疫荧光染色观察HuR在细胞中的定位及分布变化。在葡萄糖刺激前加入终浓度为10μg/mL的放线菌酮以终止总蛋白合成,提取不同细胞组份,Western blot验证HuR的核质穿梭。2 HuR对固有免疫受体NOD2 mRNA稳定性的调控2.1 NOD2在人肾组织中的表达及其与HuR的关系免疫组化染色观察NOD2在不同人肾组织标本中的表达情况。分析其与HuR表达是否存在相关性。2.2糖尿病肾病大鼠肾皮质中干扰HuR表达对NOD2的影响免疫组化和Western blot检测HuR及NOD2在糖尿病肾病大鼠肾皮质中表达变化。Western blot及组织免疫荧光观察干扰HuR对糖尿病肾病大鼠肾皮质中NOD2的影响。2.3系膜细胞中HuR对NOD2表达的影响Western blot及RT-PCR检测高糖刺激的系膜细胞中NOD2蛋白及mRNA变化。使用慢病毒包被的shRNA-HuR感染细胞,Western blot检测HuR干扰效率以及干扰HuR后NOD2表达量的变化。2.4 HuR对NOD2表达调控的机制使用放线菌素D终止细胞内mRNA合成后,检测不同时间点NOD2 mRNA在细胞内的剩余量,观察干扰HuR表达对高糖刺激下NOD2 mRNA降解速率的影响。寻找NOD2 mRNA 3’UTR区中HuR的潜在结合区域,并通过RNA-EMSA实验验证NOD2 3’UTR不同ARE序列与HuR的结合效率,明确HuR与NOD2mRNA的结合位点。为进一步证明3’UTR对NOD2 mRNA稳定性的调节作用,我们将其整合到双荧光素酶报告质粒中,转染系膜细胞,观察荧光素酶表达的强弱变化。加入高糖刺激系膜细胞后再次观察荧光素酶表达,分析高糖对3’UTR功能的影响。3 NADPH氧化酶对HuR-NOD2通路的调控3.1糖尿病肾病大鼠肾皮质氧化应激水平表征Western blot观察不同NOX蛋白在大鼠肾皮质中的表达情况。DHE检测超氧化物阴离子含量,Amplex红检测双氧水浓度。3.2系膜细胞氧化应激状态Western blot检测高糖刺激的RMC中NOX4表达。DHE检测超氧化物阴离子含量,Amplex红检测双氧水浓度。3.3 NOX4在HuR调控的NOD2表达中的作用使用siRNA干扰NOX4表达。Western blot检测干扰效率。高糖刺激转染后的系膜细胞,提取不同细胞组份,Western blot检测HuR及NOD2的表达情况。免疫荧光观察干扰NOX4后HuR在细胞内分布的变化。放线菌素D终止mRNA合成,RT-PCR检测干扰NOX4后NOD2 mRNA降解速率的变化。体外培养肾细胞NRK-52E, Western blot观察葡萄糖刺激后NOX4及HuR的表达。结果1 RNA结合蛋白HuR在糖尿病肾病中的作用及机制1.1 HuR在人肾组织中的表达及其与DN患者蛋白尿的关系免疫组化染色可见糖尿病肾病患者肾小球中HuR表达量明显上调。糖尿病肾病患者中,HuR表达量与患者蛋白尿水平呈正相关。1.2干扰肾皮质HuR表达对大鼠糖尿病肾病的影响免疫组化显示糖尿病肾病大鼠肾皮质中HuR表达升高,与肾活检标本结果一致。干扰HuR的糖尿病肾病大鼠损伤明显较糖尿病肾病大鼠减轻。炎性因子的生成量也减少。1.3高糖刺激对RMC中HuR表达及核质穿梭的影响Western blot显示高糖刺激可使HuR在细胞质及总蛋白中表达量均上升,且呈浓度依赖性和时间依赖性。细胞免疫荧光染色发现,高糖使HuR在细胞核中的染色降低,而细胞质中染色明显增强。培养基加入放线菌酮终止蛋白合成后,Western blot依然能检测到HuR在细胞质中的聚集。2 HuR对固有免疫受体NOD2 mRNA稳定性的调控2.1 NOD2在人肾组织中的表达及其与HuR的关系免疫组化染色可见糖尿病肾病肾小球中NOD2表达量明显上调。统计显示肾小球HuR与NOD2蛋白水平呈正相关。2.2糖尿病肾病大鼠肾皮质中干扰HuR表达对NOD2的影响Western blot和免疫组化结果表明糖尿病肾病大鼠肾皮质中HuR和NOD2表达水平均有升高,与肾活检标本结果一致。干扰大鼠肾皮质HuR表达后NOD2高表达受到抑制。2.3系膜细胞中HuR对NOD2表达的影响高糖刺激可时间依赖性地增加NOD2 mRNA和蛋白质的量。干扰HuR后,NOD2高表达能够被显著抑制。2.4 HuR对NOD2表达调控的机制放线菌素D(Act D)阻断mRNA转录后RT-PCR实验发现,高糖能延长NOD2mRNA半衰期,而干扰HuR后能显著抑制高糖诱导的半衰期延长。检索发现大鼠NOD2 3’UTR含有四个ARE区。序列比对显示ARE4在不同物种间高度保守。RNA-EMSA实验发现仅NOD2-ARE4探针能够与肾组织提取物相互结合形成复合物。高糖刺激可浓度依赖性地增加RMC细胞质提取物与NOD2-ARE4形成复合物的能力。且抗HuR抗体可使复合物发生超迁移现象,证明HuR参与了复合物的形成。以重组HuR蛋白作阳性对照的实验进一步确认了HuR和NOD2-ARE4的相互作用。双荧光素酶报告实验发现,相对于对照组,含有NOD2 3’UTR的质粒组荧光素酶活性显著降低,而高糖刺激后能够明显抑制其降低。以上结果说明HuR可结合于NOD2 ARE4并增加其mRNA稳定性。3 NADPH氧化酶对HuR-NOD2通路的调控3.1大鼠肾皮质氧化应激水平表征NOX4在糖尿病肾病肾皮质中表达上升明显,同时,O2-和H2O2水平也明显升高。3.2系膜细胞氧化应激状态高糖刺激可以增加RMC中NOX4的表达量并同时增加O2-和H2O2水平。3.3 NOX4在HuR调控的NOD2表达中的作用基因沉默NOX4可显著降低RMC中高糖诱导的HuR高表达和其在细胞质中的聚集。细胞免疫荧光也显示基因沉默NOX4后可减弱高糖引起的HuR核质转移。另外,干扰NOX4表达能够显著抑制高糖诱导的NOD2高表达及mRNA半衰期的延长。NRK-52E细胞中也观察到了NOX4和HuR表达的上调。提示氧化应激介导的HuR功能改变可能是肾实质细胞中的共同机制。结论1.高糖刺激下系膜细胞内以NOX4为主的NADPH氧化酶活性升高,活性氧生成增多,诱导HuR表达且向细胞质内聚集进而活化。2.细胞质内HuR与NOD2 mRNA的3’UTR(主要为ARE4)结合,使其稳定性增加,并导致其蛋白表达上调。3.NOD2介导的固有免疫反应激活导致肾皮质炎症因子增多,系膜细胞增生,基质沉积,肾脏损伤加重。4.干扰HuR后,NOD2蛋白水平降低,糖尿病肾病大鼠的肾损伤明显减轻,提示以HuR为靶点的基因干预对糖尿病肾病有潜在治疗作用。创新性本课题首次发现在大鼠系膜细胞中,高糖刺激通过NOX4促使HuR向细胞质内聚集实现对NOD2 mRNA稳定性的调控。且糖尿病肾病大鼠的体内实验证明了以HuR为靶点的基因干预可缓解糖尿病肾病肾损伤,这为临床治疗糖尿病肾病提供了新思路。