论文部分内容阅读
目的:研究逆转录病毒介导的反义端粒酶RNA基因对肝癌细胞株Bel-7402凋亡相关分子的影响。从凋亡相关基因的角度研究反义端粒酶基因诱导肝癌细胞株凋亡的作用机制。观察逆转录病毒介导的反义端粒酶RNA基因对肝癌细胞株作用的长期效应。方法:本课题组前期研究成功利用用逆转录病毒载体PLXSN构建携带正义和反义端粒酶RNA基因真核表达载体,进行质粒扩增、提取,电穿孔法将携带正义和反义端粒酶RNA基因的逆转录病毒真核表达载体质粒导入PT67包装细胞,筛选获得稳定产病毒细胞株,分别命名为PT67-hTR-EcoRI和PT67-hTR-BamHI;收集逆转录病毒上清,超速离心获得浓缩逆转录病毒,采用NIH3T3细胞检测所收集逆转录病毒的滴度;感染肝癌细胞株BEL-7402,筛选获得稳定转染目的基因的肝癌细胞克隆,分别命名为BEL-7402-hTR-EcoRI和Bel-7402-hTR-BamHI:挑取单个细胞克隆扩增培养,利用扩增端粒酶RNA基因的引物进行PCR鉴定;TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡与细胞周期,Hochest 33258标记荧光显微镜下观察细胞凋亡,Annexin V-PI（碘化丙锭）双染FCM分析细胞凋亡。Western Blot检测P53、Bax、Bcl-2蛋白表达水平变化,以β-actin作为内参照。结果:PCR鉴定可于约500bp处检测到目的基因的表达,证明基因转染成功:流式细胞术检测结果示试验组Bel-7402-hTR-BamHI细胞的凋亡率为（19.0±2.06）%,与对照组相比差别具有显著性（P＜0.01）,且试验组肝癌细胞可见G2/M期阻滞及凋亡峰。Hochest 33258染色显示Bel-7402-hTR-BamHI细胞凋亡增加。Western Blot检测到P53、Bcl-2蛋白表达水平上调,Bax表达水平下调。结论:端粒酶RNA（hTR）是端粒酶活性的一个重要组成部分,本研究数据显示通过逆转录病毒介导的反义端粒酶RNA基因能够抑制肝癌细胞株端粒酶活性,诱导细胞凋亡,其作用机制与Bcl-2/Bax通路及P53通路存在关联,证明端粒酶活性抑制是参与细胞凋亡的重要途径。