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干燥综合征(sjogren’s syndrome,SS)是以口眼干燥、泪液唾液分泌减少,可累及多脏器为临床表现,以淋巴细胞高度浸润为病理特点的弥漫性结缔组织病,分为原发性和继发性。原发性干燥综合征(primary sjogren’s syndrome PSS)从发病到病变迁延的基础是免疫功能紊乱,外分泌腺管道上皮细胞可发挥抗原递呈作用,细胞识别抗原后T、B细胞增殖,促使B细胞分化为浆细胞,进而产生大量免疫球蛋白、自身抗体,导致体液免疫过度的异常反应,聚集大量的各种细胞因子和炎症介质造成组织损伤。在此过程中有一类CD4+T细胞亚群,辅助B细胞,以趋化因子受体CXCR5为主要表面标志物,高表达特异性ICOS、BCL-6、CD40、PD-1,分泌IL-21发挥其生物学功能,起着不可或缺的作用,这类细胞称为滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell,Tfh cell)。目的:目前,国内外对Tfh细胞在SS中致病作用研究仍不是很全面,本文主要是通过流式细胞术(flow cytometry FCM)检测外周血CD4+CXCR5+T细胞表达率,实时定量PCR(RT-PCR)检测外周血CXCR5、ICOS m RNA的表达量,免疫组织化学方法(Immunohistochemical IHC)检测唇腺组织中ICOS、Bcl-6蛋白的表达情况及定位,探讨Tfh细胞在干燥综合征发病过程中其数量及生物学功能发生异常的表现。方法:1选取河北医科大学第二医院免疫风湿科2014年1月至2015年1月PSS患者30例作为PSS组,男性2例,女性28例,年龄范围40~65岁之间,平均年龄(50.47±9.96)岁,其中无系统损害患者20例,伴肺间质纤维化患者2例,肺动脉高压患者1例,免疫性血小板减少患者5例,肾小管酸中毒患者2例,入组前均未应用激素、免疫抑制剂等药物治疗。1.1流式细胞分析(FCM):30例PSS患者作为PSS组,20例健康志愿者作为健康对照组,晨起空腹采外周静脉血1ml,肝素钠抗凝,采用流式细胞术检测CD4+CXCR5+T细胞百分率,比较两组间的差异及与临床指标的相关性。1.2实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR):30例PSS患者作为PSS组,20例健康志愿者作为健康对照组,晨起空腹采外周静脉血5ml,EDTA抗凝的,用Real Time PCR方法检测PSS组和健康对照组外周血CXCR5 m RNA、ICOS m RNA表达量的变化情况。通过引物设计、提取样本总RNA、逆转录合成c DNA,RT-PCR反应体系的建立,获得各样本实时扩增曲线图和样本扩增产物溶解曲线图,计算出各样本基因相对定量分析结果。1.3免疫组织化学法(IHC):PSS患者唇腺组织为研究标本,共30例,同时选取下唇外伤、粘膜下囊肿等非自身免疫性疾病患者20例作为对照组,所有研究对象的唇腺腺泡组织标本均由4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,HE染色,免疫组织化学方法检测标本中ICOS、Bcl-6蛋白的表达及定位,以淋巴细胞浸润不同等级为观察基石,显微镜下观察两组间、等级间ICOS、Bcl-6蛋白的表达、定位的差异,与淋巴细胞、浆细胞及正常唇腺组织间的相关性,以及与生发中心的形成可能存在的联系。2临床指标归纳:回顾并总结PSS患者临床指标,包括免疫球蛋白(Ig A、Ig G、Ig M)、血沉(ESR)、抗SSA/SSB抗体等,并与本实验所检测指标进行相关性分析。3统计学分析:采用SPSS 21.0版统计软件进行统计分析,一般数据资料以(sx±)表示;两个独立样本比较服从正态分布,采用t检验,不服从正态分布采用秩和检验(U检验);多个独立样本比较服从正态分布采用方差分析,不服从正态分布采用秩和检验(H检验),计数资料比较采用卡方检验。两变量间的相关性分析,如服从正态分布采用pearson相关系数,不服从正态分布采用spearman相关系数。以检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1 FCM:PSS患者外周血中CD4+CXCR5+T细胞占CD4+T细胞百分率显著高于正常对照组,且有统计学意义(16.84±6.38 vs 12.85±2.38,P=0.001)。PSS组外周血中CD4+CXCR5+T细胞占CD4+T细胞百分率与临床指标血沉(ESR)、免疫球蛋白Ig G、Ig A、Ig M均无相关性(r=-0.096,P=0.614),(r=-0.280,P=0.133),(r=-0.276,P=0.139),(r=-0.287,P=0.123)。抗SSA、抗SSB抗体阳性组与阴性组之间无统计学差异(Z=-0.915,P=0.360),(Z=-1.011,P=0.312)。2 RT-PCR:PSS组外周血CXCR5 m RNA表达明显高于健康对照组,且有统计学意义(1.37±0.69 vs 0.57±0.12,P=0.000)。PSS组外周血ICOS m RNA表达水平与健康对照组相比上调(1.97±0.73 vs 1.54±0.58,P=0.036)。PSS组外周血中CXCR5 m RNA表达高低与临床指标血沉ESR、免疫球蛋白Ig G、Ig A、Ig M均无相关性(r=-0.065,P=0.733),(r=-0.051,P=0.788),(r=-0.177,P=0.350),(r=-0.259,P=0.167)。与抗SSA/SSB抗体阳性组与阴性组之间无差异(Z=0.000,P=1.000),(Z=-1.571,P=0.116);PSS组外周血中ICOS m RNA表达高低与临床指标血沉ESR、免疫球蛋白Ig G、Ig A、Ig M均无相关性(r=0.024,P=0.898),(r=-0.166,P=0.382),(r=-0.266,P=0.156),(r=-0.394,P=0.031),与抗SSA/SSB抗体阳性组与阴性组之间无差异(Z=-0.665,P=0.506),(Z=-1.442,P=0.149)。3 IHC:HE染色,显微镜下观察PSS组和对照组唇腺组织结构,对照组:腺泡大小分布均匀,导管排列整齐,间质无或少量炎性细胞浸润;PSS组:腺泡大小分布不等,可见部分腺体萎缩,以导管周围为明显,间质散在分布或一个多个灶性淋巴细胞浸润;免疫组化,PSS组与对照组ICOS蛋白表达水平评分分别为3.5(2,6)分,1(0,1)分,二者差异的比较有统计学意义(Z=-5.54,P=0.000);PSS组组织切片中导管细胞及其周围淋巴细胞均可检测到ICOS蛋白的表达,腺泡细胞偶可检测到阳性细胞。经统计学分析ICOS蛋白表达与导管周围淋巴细胞浸润程度呈显著正相关(P=0.020),说明ICOS蛋白与淋巴细胞浸润程度有关;PSS组与对照组Bcl-6蛋白表达水平评分分别为6(2,6)分、0(0,1)分,二者差异的比较有统计学意义(Z=-5.70,P=0.000);PSS组组织切片中导管细胞及其周围淋巴细胞均可检测到Bcl-6蛋白的表达,腺泡细胞偶可检测到阳性细胞。经统计学分析Bcl-6蛋白表达与导管周围淋巴细胞浸润程度呈显著正相关(P=0.001),说明Bcl-6蛋白与淋巴细胞浸润程度有关。4相关性分析:PSS组外周血CD4+CXCR5+T细胞的表达与外周血CXCR5 m RNA、ICOS m RNA表达水平均存在正相关性(r=0.635,P=0.000),(r=0.708,P=0.000);PSS组外周血CD4+CXCR5+T细胞的表达与唇腺组织中ICOS蛋白、Bcl-6蛋白表达水平均无相关性(r=0.031,P=0.871),(r=0.006,P=0.976);PSS组外周血CXCR5 m RNA与ICOS m RNA表达水平有相关性(r=0.665,P=0.000);PSS组外周血ICOS m RNA表达水平与唇腺组织中ICOS蛋白表达水平无相关性(r=-0.044,P=0.817);疾病组唇腺组织中ICOS蛋白与Bcl-6蛋白表达水平呈正相关性(r=0.594,P=0.001)。结论:1 PSS患者外周血CD4+CXCR5+Tfh样细胞占CD4+T细胞的比例明显升高,提示Tfh细胞可能对PSS疾病的发生发展起促进作用。2 PSS患者外周血CXCR5、ICOS基因的表达量较健康对照组升高,且二者呈正相关性,Tfh细胞可能通过表达ICOS基因发挥其生物学作用。3 PSS患者唇腺组织中ICOS、Bcl-6的表达增高,与唇腺组织中淋巴细胞的浸润程度有关,说明Tfh细胞可能在PSS患者涎腺组织损伤中起促进作用,但与外周血Tfh细胞表达相关性有待进一步研究。