肺癌是导致人类死亡的主要恶性肿瘤之一。研究已证实吸烟是引起肺癌的最主要的危险因素,约有90%的男性肺癌患者和75%-80%的女性肺癌患者是由吸烟所致。除肺癌外,吸烟还是其他多种肿瘤的致癌原因。继主动吸烟之后,被动吸烟也已被确认为人类致癌物。我国是世界上最大的烟草生产和消费国,因吸烟引发的肺癌及其他相关疾病已成为国民健康的重大威胁。吸烟所引起的肺癌包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞肺癌和小细胞肺癌四种主要的类型。鳞癌和腺癌的癌前病变过程已经比较明确,而肺神经内分泌肿瘤(包括小细胞癌和大细胞神经内分泌癌等)的癌前病变目前尚不是十分清楚,其特征性的神经内分泌标志物的表达已成为关键性的诊断指标。MAPK信号通路因其重要的生物学作用而在吸烟健康效应的研究中颇受关注。体外和体内实验均表明香烟暴露能激活MAPK/AP-1信号通路的活性。而吸烟在诱导肺上皮细胞神经内分泌分化异常以及MAPK信号通路在该过程中的作用及机制迄今尚未见任何实验研究报道。苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)是一种从十字花科蔬菜中提取的天然植物化学物。研究表明,PEITC具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学作用。PEITC可以在包括肺癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌等多种类型的癌症的致癌过程中发挥化学保护作用并且调控多种与癌症相关的转录因子蛋白酶等。本课题应用正常人支气管上皮细胞体外吸烟模型和小鼠吸烟模型结合的方法,在领域内创新性地探讨了吸烟诱导的肺细胞神经内分泌分化异常的改变、MAPK信号通路在吸烟诱导肺细胞神经内分泌分化异常过程中的作用及其机制,并在机制研究的基础上进行了体外细胞和动物干预研究,为探索吸烟所致肺上皮细胞异常改变及癌前病变的分子机制和其关键靶点,从而为肺癌早期诊断和靶向干预研究提供重要依据。第一部分MAPK通路在吸烟诱导正常人支气管上皮细胞神经内分泌分化异常中的作用机制及苯乙基异硫氰酸酯的干预研究目的:建立体外细胞吸烟处理模型,观察吸烟能否诱导正常人支气管上皮细胞(NHBE)发生神经内分泌分化异常;探讨MAPK信号通路在吸烟诱导的NHBE细胞神经内分泌分化异常中的作用及其机制;分析苯乙基异硫氰酸酯作为多靶点化学干预分子能否通过调节MAPK信号通路的活性及细胞分化基因的表达,进而有效的干预吸烟诱导的NHBE细胞神经内分泌分化异常。方法:采用MTT法检测香烟烟雾悬液(CSE)对正常人支气管上皮细胞活性的影响;不同浓度的CSE单独或与各种MAPK通路特异性抑制剂联合处理NHBE细胞,观察其对细胞形态改变;通过荧光实时定量PCR(Real-time PCR)分析CSE单独或与各种MAPK通路特异性抑制剂联合处理对NHBE细胞上皮细胞分化基因[E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白(ZO-1)、细胞角蛋白5(CK5)、细胞角蛋白13(CK13)等等]和神经内分泌分化基因[嗜铬素A(Cg A)、突触素(SYN)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经细胞黏附分子(N-CAM)、癌胚抗原(CEA)等]的m RNA表达水平的改变;用Western blot分析CSE单独或各种MAPK通路特异性抑制剂联合处理对NHBE细胞上皮细胞分化基因和神经内分泌分化基因蛋白表达水平的影响;用Western blot测定CSE单独或与各种MAPK通路特异性抑制剂联合处理对MAPK信号通路(ERK1/2、JNK、p38)的活性和AP-1(Fos家族、Jun家族)蛋白表达水平的改变;通过MTT法检测PEITC单独或与香烟烟雾悬液联合处理对NHBE细胞的细胞活性的改变;Real-time PCR分析PEITC对NHBE细胞上皮细胞分化基因和神经内分泌分化基因m RNA表达水平异常改变的干预作用;Western blot观察PEITC对吸烟诱导NHBE细胞上皮细胞分化基因和神经内分泌分化基因蛋白表达异常的恢复作用;采用Western blot测定PEITC对MAPK信号通路和AP-1蛋白表达水平的影响。结果:1.吸烟对NHBE细胞活性的影响用不同浓度的香烟烟雾悬液连续处理NHBE细胞7天,用MTT法观察其对NHBE细胞活性的影响。结果显示,在较低浓度下(1%、2%、4%)对细胞无明显毒性,较高浓度(≥8%)有明显的细胞毒性。选择1%、2%、4%浓度的香烟烟雾悬液进行后续相关实验。2.吸烟引起NHBE细胞分化形态的变化不同浓度香烟烟雾悬液连续处理NHBE细胞7天,显微镜下观察发现香烟烟雾悬液能够引起NHBE细胞分化形态的改变,使其由纺锤形、圆形或卵石形变为梭形、扁平状或条索状,且这些变化随着香烟烟雾浓度的增加而增多。3.吸烟激活NHBE细胞中MAPK/AP-1信号通路的活性用0%、1%、2%、4%浓度的香烟烟雾悬液处理NHBE细胞7天,用Western blot测定总的和磷酸化的ERK1/2、JNK和p38表达水平,分析吸烟对各种MAPK信号通路活性的影响。结果显示吸烟能剂量依赖性的激活包括ERK1/2、JNK和p38在内MAPK信号通路的活性;同时发现吸烟能剂量依赖性的上调p-c-Jun、p-c-Fos、Fos B、Fra-1、Fra-2的蛋白表达水平,而明显下降Jun B、Jun D蛋白表达水平。4.吸烟诱导NHBE细胞发生神经内分泌分化异常用0%、1%、2%、4%的香烟烟雾悬液处理NHBE细胞7天,Real-time PCR分析与细胞分化相关基因的m RNA表达水平。结果显示,吸烟能明显上调神经内分泌细胞分化相关基因Cg A、SYN、N-CAM、NSE的m RNA表达水平,同时下调上皮细胞分化相关基因E-cadherin、ZO-1、CK5、CK13的m RNA表达水平;Western blot分析结果显示,吸烟能显著上调Cg A、NSE、N-CAM、CEA等神经内分泌细胞分化基因的蛋白质表达水平,而上皮细胞分化基因(E-cadherin、ZO-1、CK5、CK13)蛋白的表达水平则明显被下调。5.MAPK通路特异性抑制剂对MAPK/AP-1活性的影响用ERK1/2、JNK、p38 MAPK通路特异性抑制剂与香烟烟雾悬液联合处理NHBE细胞,观察其对MAPK/AP-1信号通路活性的影响。U0126(ERK1/2特异性抑制剂)5μM、SB203580(p38特异性抑制剂)10μM、SP600125(JNK特异性抑制剂)10μM与吸烟联合处理NHBE细胞7天,均可分别显著抑制吸烟诱导的相应MAPK通路的激活;p38抑制剂和ERK1/2抑制剂明显逆转吸烟诱导的AP-1蛋白表达异常,而JNK抑制剂作用则较弱。6.MAPK通路在吸烟诱导的NHBE细胞神经内分泌异常中的作用用ERK1/2、JNK、p38 MAPK通路特异性抑制剂与香烟烟雾悬液联合处理NHBE细胞7天,观察MAPK通路在吸烟诱导NHBE细胞神经内分泌异常中的作用。结果显示,p38抑制剂和ERK1/2抑制剂可显著逆转由吸烟引起的NHBE细胞分化基因Cg A、SYN、N-CAM、NSE、E-cadherin、ZO-1、CK5、CK13的m RNA表达水平的变化,JNK抑制剂对吸烟诱导NHBE细胞分化基因Cg A和NCAM的上调以及下调的E-Cadherin和ZO-1的m RNA表达水平改变不明显;Western blot分析结果显示,p38抑制剂可明显逆转由吸烟引起的NHBE细胞分化基因Cg A、NSE、NCAM、CEA、E-Cadherin、ZO-1和CK5的蛋白表达水平的变化,ERK1/2抑制剂也具有类似的作用,而JNK抑制剂作用则较弱。7.p38和ERK1/2的抑制剂能逆转吸烟引起的NHBE细胞分化形态的改变用ERK1/2、JNK、p38 MAPK通路特异性抑制剂与香烟烟雾悬液联合处理NHBE细胞7天,p38抑制剂和ERK1/2抑制剂可显著逆转吸烟所引起的NHBE细胞分化形态的异常改变;JNK抑制剂对吸烟所引起的NHBE细胞分化形态变化改善作用并不明显。8.PEITC对NHBE细胞活性的影响不同浓度的PEITC单独或与香烟烟雾悬液联合处理NHBE细胞7天,分析PEITC对NHBE细胞活力的影响。随着PEITC浓度的升高,NHBE细胞的细胞活性逐渐降低,选择苯乙基异硫氰酸酯与香烟烟雾悬液联合处理未出现细胞毒性的剂量(2μM)进行后续相关实验。9.PEITC抑制吸烟诱导的NHBE细胞中MAPK/AP-1通路活性的激活用不同浓度的香烟烟雾悬液与PEITC联合处理NHBE细胞7天,PEITC在未呈现细胞毒性的情况下(2μM),能够明显抑制吸烟引起的ERK1/2、JNK和p38通路激活,并能改善AP-1蛋白活性的异常改变。10.PEITC能改善吸烟诱导的NHBE细胞神经内分泌分化异常用不同浓度的香烟烟雾悬液与PEITC联合处理NHBE细胞7天,Real-time PCR结果显示,PEITC在未呈现明显细胞毒性的条件下(2μM),能够显著恢复吸烟诱导的神经内分泌分化相关基因(Cg A、SYN、NSE)的m RNA表达水平的上调以及上皮细胞分化相关基因(E-cadherin、ZO-1、CK5)的m RNA表达的下调。同时发现PEITC能够改善吸烟诱导的神经内分泌分化相关基因(Cg A、NSE、CEA、NCAM)蛋白表达水平的上调以及上皮细胞分化相关基因(E-Cadherin、ZO-1、CK5、CK13)蛋白表达的下调。11.PEITC改善吸烟引起NHBE细胞分化形态的变化用不同浓度的香烟烟雾悬液与PEITC联合处理NHBE细胞7天,观察其对吸烟诱导的细胞形态改变的影响。结果表明,PEITC明显改善吸烟诱导的NHBE细胞形态的异常改变。结论:吸烟能够诱导正常人支气管上皮细胞发生神经内分泌分化异常,MAPK/AP-1通路在其中起着重要的调控作用;PEITC作为多靶点化学干预分子可通过调节MAPK/AP-1通路的活性及神经内分泌分化基因的表达,进而有效地干预吸烟诱导的NHBE细胞神经内分泌分化异常。为深入探讨吸烟诱导的肺神经内分泌肿瘤的分子机制及其靶向干预研究提供了重要的科学依据。第二部分MAPK信号通路在吸烟诱导BALB/c小鼠肺细胞神经内分泌分化异常中的作用机制及苯乙基异硫氰酸酯的干预研究目的:建立小鼠吸烟暴露模型,观察吸烟能否引起BALB/c小鼠肺细胞神经内分泌分化异常;探究MAPK通路在吸烟诱导BALB/c小鼠肺细胞神经内分泌分化异常中的作用及其机制;探讨苯乙基异硫氰酸酯作为多靶点化学干预分子能否通过调节MAPK/AP-1通路的活性及细胞分化基因的表达,进而有效地干预吸烟诱导的BALB/c小鼠肺细胞神经内分泌分化异常。方法:选用6-8周、体重为18-22g的成年BALB/c小鼠,按体重随机分组,每组15只,用整体吸入法(Whole-body inhalation)对动物进行吸烟处理;香烟烟雾利用负压驱动装置抽吸入可调控香烟烟雾浓度和通气量的动式半封闭有机玻璃染毒柜中,测定染毒柜中CO和总悬浮微粒(TSP)浓度;香烟烟雾暴露浓度为85 mg/m3(TSP),每天用香烟烟雾处理BALB/c小鼠6小时,一周7天,连续暴露12周,建立体内吸烟模型;香烟单独暴露或与各种MAPK通路特异性抑制剂联合处理小鼠,分别观察香烟单独暴露或与种MAPK通路特异性抑制剂联合处理后小鼠体重变化;用Real-time PCR分析香烟单独暴露或与各种MAPK通路特异性抑制剂联合处理对上皮细胞分化基因和神经内分泌分化基因m RNA表达水平的改变;Western blot观察香烟单独暴露或与各种MAPK通路特异性抑制剂联合处理上皮细胞分化基因和神经内分泌分化基因蛋白表达水平的影响;用Western blot测定香烟单独暴露或与各种MAPK通路特异性抑制剂联合处理对MAPK信号通路和AP-1蛋白表达的影响;不同浓度PEITC与香烟暴露联合处理BALB/c小鼠,观察小鼠体重改变;Real-time PCR分析PEITC处理对上皮细胞分化基因和神经内分泌分化基因m RNA表达水平改变的干预作用;Western blot观察香PEITC处理上皮细胞分化基因和神经内分泌分化基因蛋白表达水平的影响;用Western blot测定香PEITC处理对MAPK信号通路和AP-1蛋白表达的干预作用。结果:1.吸烟引起BALB/c小鼠体重下降BALB/c小鼠每天6小时,一周7天,连续香烟暴露12周,每周对小鼠进行称重。结果显示,香烟暴露组的小鼠体重明显低于对照组。2.吸烟能激活BALB/c小鼠肺细胞MAPK/AP-1信号通路的活性BALB/c小鼠每天6小时,一周7天,连续香烟暴露12周,提取肺组织蛋白,用Western blot测定MAPK/AP-1通路活性的改变。结果显示,吸烟明显激活包括ERK1/2、JNK和p38在内的MAPK通路的活性;与对照组相比,吸烟暴露组p-c-Fos、Fos B、Fra-1、p-c-Jun、Jun B的表达水平明显上调,Jun D的表达则被下调。3.吸烟能诱导BALB/c小鼠肺细胞发生神经内分泌分化异常吸烟暴露能显著上调BALB/c小鼠肺细胞神经内分泌细胞相关基因(Cg A、NSE、CEA、NCAM)并下调上皮细胞分化基因(E-cadherin、ZO-1、CK5、CK13)m RNA的表达水平;同时发现吸烟能够显著上调BALB/c小鼠肺细胞神经内分泌细胞分化相关基因蛋白表达水平,包括Cg A、N-CAM、NSE、CEA的蛋白表达水平,而E-cadherin、ZO-1、CK5、CK13等上皮细胞分化基因的蛋白表达则明显下调。4.MAPK通路特异性抑制剂对吸烟暴露的BALB/c小鼠体重的恢复作用吸烟暴露联合MAPK抑制剂组的小鼠分别用SB203580(p38特异性抑制剂)1mg/kg体重、U0126(ERK1/2特异性抑制剂)0.5mg/kg体重、SP600125(JNK特异性抑制剂)1mg/kg体重每日腹腔注射,吸烟暴露联合MAPK通路特异性抑制剂联合处理每天6小时,一周7天,连续处理12周,每周对小鼠进行称重。结果显示,BALB/c小鼠吸烟暴露12周后,吸烟组小鼠体重明显低于对照组;p38抑制剂(SB203580)可明显减轻由香烟暴露诱导的小鼠体重的降低,而ERK1/2抑制剂(U0126)和JNK抑制剂(SP600125)对可明显改善由香烟暴露诱导的小鼠体重的降低则无明显影响。5.MAPK通路特抑制剂对吸烟诱导的小鼠肺细胞MAPK/AP-1活性的影响p38特异性抑制剂、ERK1/2特异性抑制剂、JNK特异性抑制剂均可分别显著抑制吸烟诱导的小鼠肺细胞相应MAPK通路的激活;p38抑制剂(SB203580)能明显制吸烟暴露引起的小鼠肺细胞AP-1活性的上调,而ERK1/2抑制剂(U0126)和JNK抑制剂(SP600125)对吸烟诱导的小鼠肺细胞AP-1活性改变则无明显影响。6.MAPK通路在吸烟诱导的小鼠肺细胞神经内分泌分化异常中的作用Real-time PCR结果显示,p38抑制剂(SB203580)明显逆转吸烟暴露引起的小鼠肺细胞神经内分泌分化基因Cg A、NSE和SYN的m RNA水平表达上调以及上皮细胞分化基因E-cadherin、ZO-1和CK5的m RNA表达水平的下调;ERK1/2抑制剂(U0126)能在一定程度上改善吸烟引起的小鼠肺细胞神经内分泌分化基因m RNA表达的变化;JNK抑制剂(SP600125)对吸烟诱导的小鼠肺细胞分化基因m RNA表达的改变无明显影响;Western blot结果发现,p38抑制剂(SB203580)显著逆转吸烟暴露引起的小鼠肺细胞神经内分泌分化蛋白Cg A和NSE的表达上调以及上皮分化蛋白E-cadherin和ZO-1的表达下调,而ERK1/2抑制剂(U0126)和JNK抑制剂(SP600125)对吸烟诱导的小鼠肺细胞分化蛋白的改变无明显影响。7.PEITC能改善吸烟引起BALB/c小鼠体重的降低分别用500mg/kg体重和1000mg/kg体重的PEITC与香烟烟雾联合处理BALB/c小鼠,每天6小时,一周7天,连续暴露12周,每周对小鼠进行称重。结果显示,BALB/c小鼠暴露于香烟烟雾12周后,小鼠体重明显低于对照组;而PEITC与香烟暴露联合处理组的小鼠,无论在PEITC低剂量(500mg/kg体重)或高剂量(1000mg/kg),均可明显改善由香烟暴露诱导的小鼠体重的降低,其中PEITC高剂量(1000mg/kg)的作用更为显著。8.PEITC抑制吸烟诱导的BALB/c小鼠肺细胞MAPK/AP-1通路的激活分别用用500mg/kg体重和1000mg/kg体重的PEITC与香烟烟雾联合处理BALB/c小鼠每天6小时,一周7天,连续暴露12周。提取肺组织蛋白,用Western blot测定MAPK/AP-1活性的改变,结果显示,PEITC(1000mg/kg体重)明显抑制香烟暴露引起的小鼠肺细胞p38、ERK1/2、JNK的激活;同时PEITC(1000mg/kg体重)能抑制香烟暴露诱导的小鼠肺细胞AP-1蛋白的活性的异常改变。9.PEITC在吸烟诱导的小鼠肺细胞神经内分泌分化异常中的干预作用分别用500mg/kg体重和1000mg/kg体重的PEITC与香烟烟雾联合处理BALB/c小鼠每天6小时,一周7天,连续暴露12周,观察PEITC在吸烟诱导的BALB/c小鼠肺细胞神经内分泌分化异常中的干预作用。Real-time PCR结果显示,PEITC(1000mg/kg体重)明显改善吸烟诱导的神经内分泌分化相关基因Cg A、SYN和NSE的m RNA的表达上调和上皮细胞分化相关基因E-cadherin、ZO-1和CK5 m RNA表达水平的下调;Western blot结果显示,PEITC(1000mg/kg体重)明显改善吸烟诱导的神经内分泌分化基因Cg A、SYN、NSE、CEA的蛋白表达水平的上调和上皮细胞分化相关基因E-cadherin、ZO-1和CK5的蛋白表达水平的下调。结论:吸烟能够诱导BALB/c小鼠肺细胞发生神经内分泌分化异常,p38 MAPK通路在其中起着重要的调控作用;PEITC作为多靶点化学干预分子可通过调节BALB/c小鼠肺细胞p38 MAPK/AP-1通路的活性及相关细胞分化基因的表达,进而有效地干预吸烟诱导的肺细胞神经内分泌分化异常。为深入探讨吸烟诱导的肺神经内分泌肿瘤的分子机制及肺癌的早期诊断及靶向干预提供重要的科学依据。