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实验目的：通过对人生长激素(human growth hormone, hGH)结合位点1(Site1)及结合位点2(Site2)分别实施定点突变,以降低Site1与受体的亲和力,同时提高Site2与受体的结合能力,增加受体二聚,提高生物学效应；同时,通过分析hGH突变体(human growth hormone mutant, hGHmut)与其结合蛋白(human growth binding protein, hGHBP)的亲和力及其对GH缺乏的Lewis侏儒大鼠的体重与各器官重量变化的影响,探究两者的亲和力与生物学效应之间的关系,以寻找提高hGH生物学效能的规律。实验方法：1. hGHwt、hGHmut及hGHBPwt、hGHBPmut的亚克隆、表达与纯化1.1将hGH野生型(wild type, wt)的cDNA通过NdeⅠ和HindⅢ连接至载体pET20b(+)上,运用PCR定点突变的方法,对hGH Site1及Site2分别实施定点单突变和联合突变,包括(I4V、R16L、L45D、N109Y、D116F、R167K、S184F、L45D/R64D、R167K/S184F和I4V/E56D/R64M),并对突变后的目的基因进行测序鉴定。将鉴定为突变成功的重组子转化入大肠杆菌BL21(DE3),挑取单克隆,用浓度为1mM的异丙基β-D硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导目的蛋白表达,将得到的包涵体进行变性,复性及离子交换层析；然后对hGHwt及hGHmut进行SDS-PAGE电泳,紫外分光光度计检测其A260,A280的光吸收值,鉴定所得到蛋白的浓度和纯度。1.2将目的基因hGHBPwt、hGHBP-S201C和hGHBP-S237C亚克隆到表达质粒pET20b(+)中；再将所构建的表达质粒转化进入BL21(DE3)菌株,表达出相应的hGHBP;通过对含hGHBP的包涵体进行变性,复性,离子交换层析等过程,以获得纯度、浓度符合要求的重组hGHBP。2.检测hGHwt和各hGHmut与hGHBP的亲和力2.1采用放射免疫分析法(Radio-immunology ananlysis, RIA)检测纯化后的hGHwt及hGHmut与碘标人生长激素(125I-hGH)竞争结合hGHBP的能力。2.2通过BIAcore分析hGHwt和各hGHmut与hGHBP的结合动力学变化。3.离体实验和在体试验检测hGHwt及hGHmut的生物学活性3.1构建稳定表达hGHR的细胞株通过BamHⅠ和XbaⅠ双酶切将hGHR亚克隆到质粒pcDNA3.1(1)。将构建好的pcDNA3.1(+)/hGHR质粒采用电击法转染BaF3细胞,G418抗性筛选2周,将其中的阳性细胞单克隆化,扩增,同时继续维持G418抗性筛选。鉴定获得的单克隆化细胞hGHR mRNA与蛋白表达水平。3.2细胞增生试验,检测各hGH突变体对表达hGHR的BaF3细胞的促增殖效应。3.3动物实验检测hGHwt和各hGHmut的生物学活性给GH缺乏的Lewis侏儒大鼠腹腔注射hGHwt及hGHmut,剂量为0.5mg/kg·day,持续注射4周。观察其身长、体重、血清中IGF-1水平和主要器官(全脑、心脏、肝脏、肾脏)的增重趋势及血清中IGF-1水平,分析各hGHmut的在体生物学活性。4.分析各hGHmut和受体的亲和力与生物学效能之间的关系将hGHwt和各hGHmut与其结合蛋白的亲和力和其促进Lewis侏儒大鼠体重增加两者之间进行相关性分析。实验结果：1.成功获得浓度及纯度较好的hGH及hGHBP重组蛋白1.1测序结果显示,7个hGH单突变体I4V、R16L、L45D、N109Y、D116F、R167K和S184F,3个联合突变体L45D/R64D、R167K/S184F和I4V/E56D/R64M突变成功。经克隆、表达、纯化后,将获得的hGHwt及hGHmut蛋白进行去DTT SDS-PAGE电泳分析,结果显示所获重组蛋白条带单一、分子量约22kDa；紫外分光光度计检测显示：A260/A280在0.5-0.7之间,蛋白浓度在0.8～2mg/ml。1.2 SDS-PAGE电泳结果表明所制备的hGHBPwt, hGHBP-S201C和hGHBP-S237C分子量约为27.5 kDa,条带单一。紫外分光光度计检测hGHBP的A260,A280的结果显示：蛋白浓度在1～2mg/ml, A260/A280在0.5～0.6之间。2. hGHwt和各hGHmut与hGHBP的亲和力与结合动力学结果2.1 RIA结果显示,与hGHwt相比,突变体R167K和R167K/S184F的IC50降低(分别为2.18×10-8M·L-1、3.26×10-9M·L-1和6.44×10-9M·L-1),表明其亲和力升高,其中R167K升高6.69倍(p<0.001),R167K/S184F升高3.39倍；与hGHwt相比,突变体I4V、L45D、S184F、L45D/R64D和I4V/E56D/R64M的IC50升高,提示其与hGHBP的亲和力降低(*p<0.05)；突变体R16L、N109Y、D116F S1的亲和力与hGHwt相比,无显著性差异。2.2 BIAcore的实验结果显示,突变体R167K Site1与hGHBP的亲和力升高,其余各突变体(I4V、R16L、L45D、N109Y、D116F、S184F、R167K/S184F、L45D/R64D、I4V/E56D/R64M) Site1与hGHBP的亲和力基本不变或呈现降低趋势。3. hGHmut生物学活性的鉴定3.1成功建立稳定表达hGHR的细胞株BaF3-hGHR-A15测序结果显示,我们成功构建了pcDNA3.1(+)/hGHR的表达质粒,并成功筛选出稳定表达hGHR的细胞株BaF3-hGHR-A15。通过RT-PCR和Western blot鉴定显示在BaF3-hGHR-A15中,hGHR的表达水平显著提高(未转染的BaF3细胞不表达hGHR)。3.2 hGHwt和hGHmut的促细胞增殖效应MTT细胞增生实验表明,与hGHwt相比,突变体N109Y和D116F有明显的促细胞增殖的作用(*p<0.05)。3.3 hGHwt和各hGHmut对Lewis侏儒大鼠生长的影响给GH缺乏的Lewis侏儒大鼠注射hGHwt及各hGHmut后,与生理盐水对照组相比,注射hGHwt的Lewis侏儒大鼠的体重,身长,血清IGF-1水平以及全脑、心脏、肝脏和肾脏的重量明显升高(’p<0.05)。与hGHwt组相比,site1亲和力明显增高的hGHmut-R167K对Lewis侏儒大鼠的体重增长并没有促进作用,反而有轻微下降趋势(p>0.05); site1亲和力降低的S184F、L45D和L45D/R64D对体重也没有明显的作用(p>0.05)；而Site1亲和力无明显变化的Site2突变体hGHmut-N109Y,D116F则对Lewis侏儒大鼠的体重和身长增加有促进作用(*p<0.05)。4亲和力与生物学效应的相关性分析通过对hGH site1的亲和力和其生物学效能之间关系进行相关性分析,未发现hGH site1-hGHBP的亲和力与其生物学效应之间存在特定的相关性(r2=0.1177)。结论：RIA、BIAcore分析、细胞增生及在体实验结果表明,尽管GHmt-R167K Site1与hGHBP之间的亲和力大于hGHwt,但GHmut-R167K对GH依赖的BaF3-hGHR-A15细胞并没有促增殖作用,对Lewis侏儒大鼠的体重增加也没有明显的促进作用；Site1亲和力显著降低的一组突变体,对细胞增殖和对Lewis侏儒大鼠的体重也没促进效应；有趣的是,Site1亲和力无显著变化的突变体D116F和N109Y对GH依赖的BaF3细胞有明显的促增殖作用,对Lewis侏儒大鼠的体重增加有较明显的促进作用。以上实验结果提示：1.hGHwt及hGHmut Site1和hGHBP之间的亲和力与其生物学效应之间并不呈特定的相关性；2.突变体D116F和N109Y的生物学活性得到明显地提高,有可能成为高效能hGH的拟似剂。