类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以滑膜炎症及骨和软骨破坏为主要特征的慢性、系统性的自身免疫病。目前RA发病机制仍不清楚,但已有大量的研究表明B细胞和滑膜细胞参与了RA的发生和发展。其中,B细胞的异常活化被视为是RA的早期标志。B细胞活化因子（B cell-activating factor,BAFF）对T/B细胞功能至关重要,能够调节B细胞增殖、成熟、活化,辅助T细胞活化,维持浆母细胞存活和增殖。BAFF与其受体结合介导的信号转导通路促进B细胞活化、增殖及抑制凋亡,参与RA异常炎症反应和免疫应答。成纤维细胞样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLSs）是RA的效应细胞,BAFF表达在FLSs上,在RA的病程中也起关键作用。FLSs凋亡受损可导致滑膜增生,促进RA软骨的破坏,受累关节FLSs增殖是区别RA与其他关节炎症的特征。肿瘤坏死因子受体相关因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factors2,TRAF2）作为衔接蛋白,主要激活转录因子（nuclear factor of kappa B,NF-κB）信号通路和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）信号通路,参与免疫细胞的调节和维持体内平衡。在肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）的刺激下,TRAF2发生K48和K63连接的聚泛素化。TRAF2蛋白的第31位赖氨酸K31是K63聚泛素链的主要修饰位点,是TRAF2发挥接头蛋白作用所必需氨基酸。TRAF2可通过K48和K63连接的聚泛素链修饰从而调控NF-κB的活化。NF-κB是核转录因子,调节炎症进程、固有免疫应答和适应性免疫应答,参与细胞存活、凋亡,控制细胞增殖和肿瘤细胞侵袭的基因表达。在RA的B细胞中,BAFF-BAFFR-TRAF2-NF-κB信号通路是否活化?是否参与RA的病理机制?BAFF-BAFFR-TRAF2-NF-κB信号蛋白表达又是如何的呢,TRAF2是否是关键信号分子?目前暂无报道。芍药苷-6-氧-苯磺酸酯（Paeoniflorin-6-oxo-benzenesulfonate,CP-25）是芍药苷（Paeoniflorin,Pae）结构修饰单体化合物。前期研究发现CP-25对小鼠胶原诱导性关节炎（collagen induced-arthritis,CIA）及大鼠佐剂性关节炎（adjuvant arthritis,AA）具有较好的治疗作用。CP-25能够通过作用TNF-α介导的信号通路抑制树突状细胞的成熟,调节树突状细胞的功能。CP-25（50mg/kg）联合低剂量来氟米特（Leflunomide,LEF）/甲氨喋呤（Methotrexate,MTX）治疗大鼠AA的疗效与高剂量MTX/LEF单用的疗效一致。CP-25可降低人外周血B细胞中BAFF刺激的BAFF受体,TRAF2和NF-κB信号蛋白的表达。那么CP-25是否通过调控B细胞功能发挥治疗小鼠CIA?CP-25对B细胞的调控是否通过BAFF-BAFFR-TRAF2-NF-κB信号通路?CP-25是否通过影响TRAF2的磷酸化和泛素化活性调控BAFF介导的NF-κB信号?本课题以CIA小鼠、HEK293转染细胞和MH7A滑膜细胞为研究对象,采用流式细胞术法、激光共聚焦法、免疫共沉淀法、TRAF2-si RNA沉默TRAF2、质粒过表达TRAF2和western blot等方法,观察CP-25对CIA小鼠的治疗作用及对B细胞功能的影响,阐明CP-25通过调控BAFF-BAFFR-TRAF2-NF-κB信号通路来抑制B细胞的活化和分化的机制,阐明CP-25通过影响TRAF2的磷酸化和泛素化调控BAFF介导的NF-κB信号,为研究RA的作用机制和药物靶点提供实验依据。目的:1.观察CP-25对CIA小鼠的治疗作用及对B细胞功能的影响。2.研究CP-25通过调控BAFF-BAFFR-TRAF2-NF-κB信号通路来抑制B细胞活化和分化。3.阐明CP-25通过影响TRAF2的磷酸化和泛素化活性调节BAFF介导的NF-κB信号。方法:1.选取DBA/1雄性小鼠建立CIA小鼠模型,随机分为5组,分别为正常组、CIA模型组、CP-25组、利妥昔单抗组和依那西普组。灌胃给予CP-25（35mg/kg）药物,腹腔注射利妥昔单抗（5mg/kg）和依那西普（5mg/kg）给药。对CIA小鼠全身评分,关节炎指数评分,计数足爪肿胀数,测定CIA小鼠体重,检测脾脏和胸腺指数,CCK-8法检测T、B淋巴细胞增殖反应,对小鼠脾脏和踝关节进行HE染色,观察小鼠脾脏和踝关节病理组织学变化。2.流式细胞术检测不同炎症时期小鼠外周血和脾脏B细胞亚群和BAFF受体的百分比和数量:CD19+总B细胞、CD19+CD27+活化的B细胞、CD27+CD19–CD138+浆细胞、CD19+BAFFR+和CD19+TACI+细胞。3.酶联免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和蛋白芯片法检测小鼠血清中BAFF和免疫球蛋白Ig G1、Ig A、Ig G3、Ig E、Ig D、Ig M、Ig G2a和Ig G2b的表达。4.免疫组化法观察小鼠脾脏中的TRAF2表达,蛋白印迹法检测小鼠脾脏B细胞中TRAF2、MKK3、MKK6、p-P38和p-P65的表达。5.CCK-8法检测BAFF刺激的小鼠脾脏细胞的增殖反应,流式细胞术检测BAFF刺激的小鼠脾脏CD19+TRAF2+细胞百分比。6.CCK-8法检测不同浓度BAFF刺激MH7A细胞的增殖反应,Transwell法检测不同浓度的BAFF刺激对MH7A细胞迁移功能的影响。7.免疫组化法检测BAFF刺激的MH7A细胞中TRAF2表达。蛋白印迹法检测TRAF2-si RNA干扰TRAF2后对MH7A细胞中BAFF介导的NF-κB信号蛋白的影响。8.免疫共沉淀法和激光共聚焦法检测CP-25对BAFF刺激的MH7A细胞中TRAF2和BAFFR、TRAF2和GRK2、TRAF2和NIK共表达的影响。9.流式细胞术检测CP-25对BAFF刺激的MH7A细胞中BAFFR、TRAF2和GRK2细胞百分比。10.构建p IRES2-EGFP-TRAF2-wt、p IRES2-EGFP-TRAF2-K31R、p IRES2-EGFP-TRAF2-K320R、p IRES2-EGFP-TRAF2-K31RK320R质粒,并将其转染至HEK293细胞和MH7A细胞。蛋白印迹法检测HEK293细胞和MH7A细胞中过表达的TRAF2水平。结果:1.CP-25对小鼠CIA有明显的治疗作用D29开始每三天进行一次小鼠全身评分,关节炎指数评分,计数足爪肿胀数,测定体重指标。结果发现CIA小鼠足爪出现红肿,关节炎指数和足爪肿胀数随着病程的发展而升高,体重明显低于正常组。CP-25组CIA小鼠的足爪肿胀数从d63逐渐下降,关节炎指数d65逐渐下降。利妥昔单抗组小鼠足爪肿胀数从d55逐渐减轻,关节炎指数d63逐渐下降。依那西普组小鼠足爪肿胀数和关节炎指数均从d55逐渐减轻。CP-25、利妥昔单抗和依那西普明显恢复CIA小鼠异常降低的体重。与CP-25组小鼠相比,利妥昔单抗和依那西普降低CIA小鼠关节炎指数和足爪肿胀数更明显。2.CP-25能够降低CIA小鼠胸腺和脾脏指数,抑制脾脏B淋巴细胞和T淋巴细胞增殖反应,改善脾脏和关节组织病理变化CIA小鼠脾脏指数,胸腺指数明显高于正常组,胸腺T细胞和脾脏B细胞的增殖能力明显增加。CIA模型组小鼠脾脏生发中心边缘模糊且数量较多,淋巴滤泡数量明显增加,动脉周围淋巴鞘的密度和边缘区的细胞密度增大,且红髓淤血。H&E染色结果发现正常小鼠关节组织切片中关节面清晰可见,光滑且完整,关节间隙均匀,软骨外侧可看见整齐排列的单层或双层滑膜细胞层;与正常组小鼠相比,CIA模型组小鼠关节滑膜组织中滑膜细胞增生明显,层数增多,排列紊乱,纤维组织增生,炎性细胞浸润及血管翳形成,软骨组织严重破坏。CP-25、利妥昔单抗和依那西普明显抑制胸腺指数和脾脏指数,降低CIA小鼠的胸腺T细胞和脾脏B细胞的异常增殖,降低CIA小鼠淋巴滤泡和生发中心的数量,减轻红髓淤血,改善CIA小鼠滑膜细胞增生及骨侵蚀情况;利妥昔单抗和依那西普对T细胞增殖反应抑制作用更强并将T淋巴细胞抑制至正常水平以下。利妥昔单抗和依那西普还可抑制动脉周围淋巴鞘的密度和边缘区细胞的密度,抑制CIA小鼠血管翳形成和软骨组织破坏等炎症情况。3.CP-25降低不同炎症时期CIA小鼠外周血中B细胞亚群的百分比结果显示造模之前各组小鼠之间CD19+总B细胞、CD19+CD27+活化的B细胞和CD27+CD19–CD138+浆细胞百分比没有统计学意义。第21天再次免疫时各组之间CD19+总B细胞、CD19+CD27+活化的B细胞和CD27+CD19–CD138+浆细胞百分比没有统计学意义,但与正常小鼠相比,造模免疫组小鼠CD19+总B细胞、CD19+CD27+活化的B细胞和CD27+CD19–CD138+浆细胞百分比有增加趋势。第35天比较各组小鼠外周血中B细胞亚群,结果显示与正常组小鼠比较,CIA模型组小鼠CD19+总B细胞和CD27+CD19–CD138+浆细胞百分比显著增加。CP-25组小鼠与利妥昔单抗组小鼠和依那西普组小鼠的CD27+CD19–CD138+浆细胞百分比明显降低。第45天和第65天比较各组小鼠外周血中B细胞亚群,结果显示与正常组小鼠比较,CIA模型组小鼠CD19+总B细胞、CD19+CD27+活化的B细胞及CD27+CD19–CD138+浆细胞百分比显著增加;第45天结果显示与CIA模型组小鼠比较,CP-25降低CIA小鼠CD19+CD27+活化的B细胞及CD27+CD19–CD138+浆细胞百分比,利妥昔单抗和依那西普降低CIA小鼠CD19+总B细胞、CD19+CD27+活化的B细胞及CD27+CD19–CD138+浆细胞百分比;与CP-25组小鼠比较,依那西普降低CIA小鼠CD27+CD19–CD138+浆细胞百分比的程度更大。第65天结果显示与CIA模型组小鼠比较,CP-25组、利妥昔单抗组和依那西普组CD19+总B细胞、CD19+CD27+活化的B细胞及CD27+CD19–CD138+浆细胞的百分比和细胞数量不同程度的降低。与CP-25组小鼠比较,依那西普抑制CIA小鼠CD19+总B细胞、CD19+CD27+活化的B细胞及CD27+CD19–CD138+浆细胞的百分比的程度更大,抑制CD27+CD19–CD138+浆细胞的数量更多。与正常组小鼠比较,依那西普抑制CIA小鼠CD19+CD27+活化的B细胞及CD27+CD19–CD138+浆细胞的百分比和细胞数量到正常水平以下。4.CP-25降低不同炎症时期CIA小鼠外周血中CD19+BAFFR+细胞和CD19+TACI+细胞的百分比检测结果显示小鼠外周血中CD19+BAFFR+、CD19+TACI+细胞百分比在造模成功后明显升高,分析结果显示造模之前第0天、第21天和第35天各组之间小鼠外周血中的CD19+BAFFR+和CD19+TACI+细胞百分比没有统计学意义。第45天比较各组小鼠外周血中CD19+BAFFR+和CD19+TACI+细胞百分比,结果显示,与正常组小鼠比较,CIA模型组小鼠CD19+BAFFR+和CD19+TACI+细胞百分比明显增加。与CIA模型组小鼠比较,CP-25和依那西普在第45天开始降低CD19+BAFFR+细胞百分比。第65天比较各组小鼠外周血中CD19+BAFFR+和CD19+TACI+细胞的百分比和数量,结果显示,与正常组小鼠比较,CIA模型组小鼠CD19+BAFFR+、CD19+TACI+细胞百分比和细胞数量明显增加。与CIA模型组小鼠比较,CP-25、利妥昔单抗和依那西普降低CIA小鼠CD19+BAFFR+和CD19+TACI+细胞百分比和细胞数量。5.CP-25降低CIA小鼠脾脏中B细胞亚群、CD19+BAFFR+细胞和CD19+TACI+细胞的百分比与正常组小鼠比较,CIA小鼠脾脏中CD19+总B细胞、CD19+CD27+活化的B细胞、CD27+CD19–CD138+浆细胞、CD19+BAFFR+及CD19+TACI+细胞百分比和细胞数量显著增加。CP-25可以降低脾脏中CD19+总B细胞、CD19+CD27+活化的B细胞、CD27+CD19–CD138+浆细胞、CD19+BAFFR+及CD19+TACI+细胞百分比和细胞数量。依那西普降低CIA小鼠脾脏中CD19+CD27+活化的B细胞或CD27+CD19–CD138+浆细胞的百分比和细胞数量到正常水平以下。与CP-25组相比,利妥昔单抗和依那西普对B细胞亚群的抑制作用更强。6.CP-25降低CIA小鼠血清BAFF和免疫球蛋白Ig A、Ig D、Ig G1、Ig G2a和Ig G2b的水平与正常组小鼠比较,CIA小鼠血清BAFF水平升高,血清免疫球蛋白Ig G1、Ig A、Ig E、Ig D、Ig G2a和Ig G2b的表达明显增加。CP-25降低CIA小鼠的Ig A、Ig D、Ig G1、Ig G2a和Ig G2b蛋白的水平,下调CIA小鼠的Ig A,Ig G1、Ig D、Ig G2a和Ig G2b的表达到生理平衡水平。利妥昔单抗抑制CIA小鼠的Ig A和Ig G2a蛋白的表达至正常水平以下。依那西普抑制CIA小鼠的Ig A、Ig G1和Ig G2a蛋白的表达至正常水平以下。CP-25、利妥昔单抗和依那西普三种药物对CIA小鼠的Ig G3和Ig M蛋白表达没有影响。7.CP-25降低CIA小鼠脾脏中TRAF2、MKK3、MKK6、p-P38和p-P65的表达蛋白印迹法结果显示与正常组小鼠比较,CIA小鼠脾脏B细胞中的TRAF2、MKK3、MKK6、p-P38、p-P65的表达明显升高。免疫组化法结果显示CIA小鼠脾脏B细胞中的TRAF2数量显著增加。CP-25、利妥昔单抗和依那西普降低CIA小鼠脾脏B细胞中的TRAF2、MKK3、MKK6、p-P38和p-P65的表达。与CP-25组小鼠比较,利妥昔单抗抑制CIA小鼠的TRAF2、MKK6和p-P38的表达的程度更大,依那西普抑制CIA小鼠的TRAF2、MKK3、MKK6、p-P38和p-P65表达的程度更剧烈。与正常组小鼠比较,利妥昔单抗和依那西普不同程度抑制CIA小鼠的MKK6、p-P38和p-P65的表达至正常水平以下。CP-25可下调CIA小鼠的MKK6和p-P38的表达到正常的水平。8.CP-25降低BAFF刺激的小鼠脾淋巴细胞的增殖反应,抑制小鼠脾脏CD19+TRAF2+细胞的表达BAFF可刺激小鼠脾脏淋巴细胞明显增殖,促进脾脏CD19+TRAF2+细胞的表达。CP-25（10-5mol/L）降低BAFF刺激的小鼠脾脏淋巴细胞增殖和脾脏CD19+TRAF2+细胞的表达。依那西普抑制BAFF刺激的小鼠脾脏淋巴细胞增殖影响和脾脏CD19+TRAF2+细胞表达的程度更大,可将小鼠脾脏CD19+TRAF2+细胞的表达降低到正常水平以下。9.CP-25抑制BAFF刺激的MH7A细胞的迁移,对BAFF刺激的MH7A细胞的增殖无影响低浓度的BAFF（400ng/ml）对MH7A细胞的增殖没有影响,高浓度的BAFF（800ng/ml）可刺激MH7A细胞的增殖,促进MH7A细胞迁移。CP-25对BAFF刺激的MH7A细胞增殖无影响。CP-25、依那西普和MTX降低MH7A细胞迁移。10.TRAF2-si RNA干扰TRAF2后降低MH7A细胞中BAFF介导的NF-κB信号蛋白结果显示,TRAF2-si RNA干扰MH7A细胞中TRAF2的表达后,BAFF刺激的MH7A细胞中NIK、p-IKKα和P100/52-NF-κB的蛋白表达明显降低。TRAF2-si RNA干扰MH7A细胞对BAFFR的表达无影响。11.CP-25降低MH7A细胞中BAFFR、TRAF2和GRK2细胞的百分比与空白组比较,BAFF刺激的MH7A细胞中BAFFR、TRAF2和GRK2细胞百分比显著增加。与BAFF刺激组比较,CP-25、依那西普和MTX降低BAFF刺激的MH7A细胞中BAFFR、TRAF2和GRK2细胞的百分比。与CP-25组比较,MTX降低BAFF刺激的MH7A细胞中BAFFR百分比的程度更大。12.CP-25降低MH7A细胞BAFF介导的NF-κB信号通路中BAFFR、BCMA、TRAF2、GRK2、p-P38、p-P65、c IAP1、NIK、p-IKKα和P100/52-NF-κB蛋白表达BAFF刺激的MH7A细胞经典NF-κB信号通路中BAFFR、BCMA、TRAF2、GRK2、p-P38和p-P65的表达显著增加,非经典NF-κB信号通路中c IAP1、NIK、p-IKKα和P100/52-NF-κB蛋白表达明显升高。CP-25、依那西普和MTX降低BAFF刺激的MH7A细胞中BAFFR、BCMA、TRAF2、GRK2、p-P38、p-P65、c IAP1、NIK、p-IKKα和P100/52-NF-κB蛋白表达。与CP-25组比较,依那西普和MTX抑制BAFF刺激的MH7A细胞中GRK2、p-P65、TRAF2和c IAP1蛋白表达的程度更大。13.CP-25降低MH7A细胞中TRAF2和BAFFR、TRAF2和GRK2的共表达,对TRAF2和NIK共表达无影响在正常情况下,MH7A细胞中TRAF2-BAFFR、TRAF2-GRK2和TRAF2-NIK有比较弱的共表达,BAFF刺激后的MH7A细胞中TRAF2-BAFFR、TRAF2-GRK2和TRAF2-NIK共表达显著增强。CP-25减弱了TRAF2和BAFFR的共表达,同时也减弱TRAF2和GRK2的共表达。CP-25对BAFF刺激的TRAF2和NIK共结合有降低趋势,但无统计学差异。14.TRAF2质粒和TRAF2重组突变质粒的构建和表达利用分子生物学方法构建p IRES2-EGFP-TRAF2-wt、p IRES2-EGFP-TRAF2-K31R、p IRES2-EGFP-TRAF2-K320R、p IRES2-EGFP-TRAF2-K31RK320R质粒,并将其转染至HEK293细胞和MH7A细胞。荧光显微镜下可观察绿色荧光蛋白以及质粒的转染效率。蛋白印迹法检测TRAF2蛋白在HEK293细胞和MH7A细胞中成功表达。15.CP-25抑制HEK293细胞和MH7A细胞中过表达的TRAF2的水平过表达的TRAF2转染HEK293细胞和MH7A细胞,CP-25能够降低HEK293细胞和MH7A细胞中p IRES-EGFP-TRAF2-wt蛋白的表达。CP-25对HEK293细胞和MH7A细胞中p IRES2-EGFP-TRAF2-K31R和p IRES2-EGFP-TRAF2-K320R蛋白表达无影响。结论:1.BAFF参与CIA的发病机制。2.在CIA小鼠的B细胞中,BAFF-BAFFR-TRAF2-NF-κB信号异常活化参与CIA发病进程。3.CP-25对CIA小鼠的治疗作用。4.CP-25通过调控BAFF-BAFFR-TRAF2-NF-κB信号通路抑制B细胞功能,进一步抑制B细胞的活化、分化和免疫球蛋白分泌。5.CP-25通过影响TRAF2的磷酸化和泛素化调控BAFF介导的NF-κB信号。6.TRAF2-K31位和TRAF2-K320位可能是CP-25的作用位点。