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目的:缺氧损伤见于多种中枢神经系统疾病,如脑梗死、脑出血、脑肿瘤、高原脑水肿等等。研究发现,缺氧可以引起脑部一系列功能蛋白和基因表达的变化,如脑红蛋白等等。其中缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF）是目前已知的介导缺氧过程最重要的核转录因子,可以调控上百种基因的表达。HIF调控的缺氧通路广泛参与能量代谢、细胞周期调节、血管生成、细胞凋亡和肿瘤侵袭等病理过程,是缺氧过程中重要的调控因子。到目前为止,脑缺氧损伤的机制和调控通路并不完善,探索脑缺氧损伤新的调控因子,进一步完善缺氧通路,可以为我们提供神经保护的新靶点,对于脑部缺氧性疾病的预防和治疗具有重要意义。为寻求新的缺氧相关标志性因子,本课题组利用基因芯片及mi RNA芯片等技术对低压缺氧大鼠脑皮质进行差异因子的检测,发现了TFPI-2和mi R-92a-2这两个具有靶向关系的差异表达因子,其中TFPI-2表达与缺氧呈正相关,mi R-92a-2则相反。组织因子途径抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2）是一种天然的抗凝因子,是内源性TF抑制物,属Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制家族。TFPI-2是一种广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂,可以抑制包括纤溶酶、基质金属蛋白酶等在内多种蛋白酶的活性,维持细胞外基质的完整性。研究发现,TFPI-2参与多种恶性肿瘤的转移和侵袭过程,与肿瘤组织血管生成、细胞凋亡等过程密切相关。但是TFPI-2在缺氧过程中的变化及调控机制没有得到充分研究,TFPI-2是否通过HIF经典途径参与细胞缺氧损伤也并不清楚。氯化钴是常用的细胞化学缺氧诱导剂,可抑制HIF-1α降解,激活HIF缺氧通路,模拟细胞缺氧环境。本实验拟通过建立SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞氯化钴化学缺氧细胞损伤模型,探究TFPI-2在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞缺氧损伤中的变化及可能的调控机制。方法:1 CoCl2缺氧对SH-SY5Y细胞活性和形态的影响1.1培养SH-SY5Y细胞,加入不同浓度CoCl2（0、100、200、400μmol/L）处理细胞,分别在6小时和24小时通过倒置显微镜观察细胞生长状态,对细胞进行HE染色,观察细胞化学缺氧前后形态变化。1.2使用不同浓度CoCl2（0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500μmol/L）处理SH-SY5Y细胞,利用MTT法检测细胞活性变化。1.3用100μmol/L CoCl2处理SH-SY5Y细胞,MTT法检测缺氧不同时间（0、6、12、24、48、72小时）细胞活性变化。2 CoCl2缺氧前后SH-SY5Y细胞TFPI-2、mi R-92a表达水平检测2.1利用Western blot技术,检测100μmol/L CoCl2缺氧不同时间（1、2、4、6、8小时）SH-SY5Y细胞HIF-1α和TFPI-2、VEGF表达水平,对氯化钴化学缺氧后基因表达变化趋势进行分析。2.2 Real-time PCR法检测100μmol/L CoCl2缺氧8h后HIF-1αm RNA、TFPI-2 m RNA和VEGF m RNA表达变化。2.3 Real-time PCR法检测100μmol/L CoCl2缺氧8h后mi R-92a表达变化。3 YC-1预处理对SH-SY5Y细胞缺氧后TFPI-2表达的影响3.1用10μmol/L、100μmol/L YC-1预处理细胞2小时,对照组加入相同浓度的DMSO培养2小时,然后加入100μmol/L CoCl2共培养细胞8h,Ed U法检测各组细胞增殖活性变化。3.2 Western blot检测缺氧后YC-1预处理对缺氧后细胞TFPI-2、HIF-1α、VEGF蛋白表达水平的影响。结果:1 CoCl2缺氧对细胞形态产生影响并降低细胞存活率CoCl2缺氧后SH-SY5Y细胞胞体变小,突触变细变短,核仁膨胀,随着氯化钴浓度缺氧时间延长,细胞逐渐出现皱缩凋亡。通过MTT检测发现,CoCl2缺氧处理会显著降低细胞活性（P<0.05）,细胞存活率下降呈剂量和时间依赖性。2 CoCl2缺氧可以降低细胞内mi R-92a含量,上调TFPI-2 m RNA和蛋白表达水平Western blot结果显示,CoCl2缺氧处理后2小时细胞内HIF-1α、VEGF蛋白表达水平开始升高,在6-8小时趋于稳定。CoCl2处理可以有效激活HIF缺氧通路,建立细胞缺氧模型。缺氧4小时后TFPI-2蛋白表达水平开始升高（P<0.05）,随着缺氧时间延长,细胞内TFPI-2表达水平逐渐升高而后稳定表达,与HIF-1α变化趋势相似。Real-time PCR结果显示,与对照组相比,缺氧组细胞TFPI-2、VEGF m RNA表达显著上升,而缺氧组细胞mi R-92a表达水平较对照组明显降低（P<0.05）。3 YC-1预处理可减弱CoCl2缺氧对细胞增殖活性的抑制,降低缺氧后SH-SY5Y细胞内TFPI-2表达水平。Ed U检测显示,缺氧后,SH-SY5Y细胞增殖活性降低,而YC-1预处理可减弱缺氧对细胞增殖的抑制作用（P<0.05）。Western blot结果显示,与缺氧组相比,YC-1预处理可以抑制缺氧后细胞HIF-1α水平,在YC-1预处理组VEGF、TFPI-2蛋白表达水平较缺氧组降低,呈剂量依赖性（P<0.05）。结论:本实验成功建立SH-SY5Y细胞氯化钴化学缺氧模型,证实TFPI-2m RNA及蛋白水平在SH-SY5Y细胞化学缺氧后显著升高,其表达变化可能受HIF-1—VEGF缺氧途径调控。