体细胞核移植技术已成为转基因动物制作的主要技术，使用预先筛选的修饰细胞作为核供体，可以大大提高转基因动物的制作效率。在转基因细胞的研究中，一般采用外源基因随机插入的方法，严重制约了转基因牛纯系的快速建立和转基因的稳定遗传，是转基因牛研究函待解决的首要问题。转基因定点整合技术，即基因打靶技术是解决上述问题的重要途径，但是基因打靶存在打靶效率太低的问题。本研究小组以奶牛rDNA基因(rRNA的基因)及其间隔序列作为同源重组引导序列，已构建含新霉素抗性基因(NEO)和HSV胸苷激酶基因(TK)的正负筛选基因以及绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的通用型奶牛多位点基因打靶载体。本研究将对奶牛胎儿成纤维细胞进行多位点基因打靶，培养出转基因的单克隆细胞系，为今后核移植制作定点转基因奶牛提供细胞基础。主要研究内容如下： 1．采用组织块贴附培养的方法分离培养出2-5月龄奶牛胎儿耳尖成纤维细胞，通过PCR方法鉴别胎儿成纤维细胞的性别，筛选出雌性胎儿成纤维细胞，经2～3次传代纯化后扩大培养，冷冻保存。观察了奶牛胎儿成纤维细胞的生长特点，绘制了生长曲线。分析了体外培养第8代和第15代细胞的核型特征，核型正常率为91.7％和86.1％，符合用于转基因克隆的要求。 2．经过反复摸索与尝试，最终发现QIAGEN公司的大片段(Large-Construct)去基因组污染试剂盒(适合于提取BAC、PAC等大基因DNA)可成功提取的大片段(27KB)BAC质粒。 3．使用Lipofectamine2000脂质体介导法转染胎儿成纤维细胞。转染24-48h观察GFP瞬时表达，研究发现：OD260/OD280值在1.68～1.94的质粒转染效果较理想；2～6代细胞均有较理想的转染效率，8代以上细胞转染效率下降：脂质体量每孔(六孔板)在4～15μl之间转染效率成升高趋势：质粒DNA量每孔(六孔板)在1～6μg之间时，随着质粒DNA量的增加转染效率成上升趋势。 4．通过酶标仪MTT比色法试验，确认了800μg/mL筛选药物G418用于细胞的快速杀死，300μg/ml，适于转基因细胞的维持浓度；确定了10μg/mL的GCV对奶牛胎儿成纤维细胞的抑制率为7.08％，而此浓度足以杀死随机整合的细胞，适合于转基因细胞的负筛选。 5．细胞转染24～48小时在荧光镜下各组均可检测到绿色荧光的表达，48小时后用含80μg/mLG418的培养液筛选7d，300μg/mL G418和10μg/mL的GCV同时进行筛选10d，之后用克隆杯对细胞集落进行收获，扩大培养并冻存。 6．对收集的7个克隆细胞系进行DNA和RNA水平鉴定，结果证明7个克隆细胞系均可检测到筛选基因、EO基因的存在和GFP基因的表达，其中一个初步鉴定为定点克隆细胞系。观察转基因细胞系的生长曲线，核型正常率为66.7％，满足核移植需要。