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对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)自1992年首次暴发以来对全球虾类养殖业造成严重危害,是广受关注的甲壳类病毒新种(Whispovirus)。目前主要集中于寻找WSSV与宿主相结合的粘附蛋白上,从而研制相应的阻断疫苗以达到防治目的。
本论文主要分为两个部分:第一部分关于WSSV核酸疫苗的构建,采用的是真核表达载体pEGFP-N1,含有绿色荧光蛋白标签便于检测和定位,目的基因为vp37和vp31。第二部分关于WSSV-VP90蛋白表达与功能的研究,原核表达VP90p片段,制备抗体进行功能研究。
本实验通过体外PCR扩增的方式,构建pEGFP-N1-vp37、pEGFP-N1-vp31DNA疫苗,研究其对对虾的免疫活性。首先通过细胞转染的手段验证了构建的真核重组载体可以稳定的在真核细胞中表达目的蛋白,然后采用注射和饲料添加投喂的方式免疫对虾,通过分析对虾体内相关酶的活性变化及累计死亡率,验证重组质粒的免疫保护效果。结果表明,VP37-80组免疫效果最好,相对免疫保护率37%左右,VP31组的相对免疫保护率为31%左右,饲料添加裸露的质粒免疫保护效果低于注射免疫。
此外利用生物信息学软件分析VP90的功能区域,根据功能区域设计引物并引入Xhol和EcorⅠ酶切位点,通过体外PCR扩增手段成功构建了原核表达载体pBAD/gⅢB-VP90P。通过发酵条件优化得到最优的发酵时间和诱导剂浓度为诱导4h,诱导浓度为0.02%。利用Co2+亲和层析的方法纯化蛋白,纯度高达90%。利用昆明小鼠制备蛋白的抗体,ELISA法检测抗体效价均达到1:600。用纯化的抗体对重组VP90P和病毒进行Western Blot分析,呈现特异性条带,表明抗体制备成功。ELISA和荧光显微镜分析表明VP90P与对虾鳃细胞膜、血淋巴细胞及血蓝蛋白具有结合活性,为以后的研究提供理论基础。