论文部分内容阅读
【研究目的】脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)导致轴突严重受损和神经元死亡,从而导致运动或感觉功能永久丧失。雪旺氏细胞(Schwann cells,SCs)是主要的神经胶质细胞,在周围神经损伤后,SCs可以去除髓鞘和轴突碎片,促进轴突的去分化和增殖来再生轴突。其再生能力已被逐渐应用于中枢神经系统的损伤。外泌体是细胞分泌的细胞外囊泡,参与细胞间通讯。而自噬(Autophage)是一种细胞内物质被降解的代谢过程,在生理和病理过程中都起着重要作用。许多研究表明,雪旺细胞分泌的外泌体可以促进组织修复和维持稳态,并与自噬密切相关。这项研究的目的是调查雪旺氏细胞外泌体在SCI后轴突再生中的作用及可能参与其中的分子机制,并希望为临床SCI的治疗提供线索。【方法】1.从Wistar大鼠坐骨神经中提取原代雪旺细胞,取雪旺细胞培养上清进行多次超速离心来获得外泌体,并通过透射电镜和Western-blot检测外泌体标志物CD9,CD63和Alix来进行外泌体鉴定。2.通过BBB行为学评分(Basso,Beattie&Bresnahan locomotor rating scale,BBB scale),HE染色,LFB染色,以及免疫荧光染色检测Ch AT/Neu N,与对照组进行比较来观察经过雪旺氏细胞外泌体(Schwann cell-derived exosomes,SCDEs)治疗后SCI大鼠的功能恢复。3.通过TUNEL染色来观察体内神经元的凋亡情况以及通过Western-blot来检测SCI后对照组和SCDEs治疗组之间自噬标记物LC3-1/2,Beclin-1,P62的变化。引入氯喹来抑制自噬的发生,检测SCI后在相同浓度SCDEs的处理下,自噬发生量的变化。4.在体外培养PC12细胞系,诱导其分化为神经元细胞,并通过过氧化氢干预建立体外SCI模型,通过流式细胞术以及TUNEL染色来观察对照组,过氧化氢组,过氧化氢加SCDEs处理组之间的神经元细胞存活情况。同时通过Western-blot来检测不同组之间自噬标记物LC3-1/2,Beclin-1,P62的变化。5.通过Western-blot检测表皮生长因子(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR),Akt,m TOR表达量的变化进而探究SCDEs影响SCI后恢复的相关信号通路。【结果】1.本实验从大鼠原代培养的雪旺细胞中提取了外泌体。并通过Western-blot发现这些外泌体表达三种外泌体标记:CD9,CD63和Alix。此外,通过TEM测定,SCDEs的尺寸范围为40-100 nm。2.对于体内实验,在SCDEs治疗组和对照组大鼠的BBB评分之间存在统计学上的显著变化(n=6)。HE染色和LFB染色评估脊髓中髓磷脂的含量显示,SCDEs给药后,髓鞘区域的髓磷脂含量百分比显著增加,而空化面积显著减少。免疫荧光结果表明,用SCDEs处理的大鼠在损伤部位的Neu N和Ch AT含量均高于磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)处理组,差异具有统计学意义。3.通过TUNEL染色观察凋亡情况,结果发现与空白对照组相比,SCI组的凋亡细胞数量显著增加,而SCDEs处理组的凋亡细胞数量则显著减少。同时LC3-1/2,Beclin-1和P62的Western-blot表达结果表明,与未治疗的SCI组相比,SCI后SCDEs治疗组中受损脊髓表达自噬标记物的量增加。此外,当通过氯喹阻断自噬时,可阻止SCDEs诱导三种自噬标记物的增加。差异具有统计学意义。4.体外流式细胞术评估凋亡的结果表明,H2O2诱导的损伤增加了神经元细胞的凋亡,而SCDEs处理则降低了凋亡。此外,SCDEs处理导致受H2O2诱导损伤的神经元细胞中LC3-1/2,Beclin-1和P62的表达水平增加,而在氯喹存在下,这些SCDEs诱导的表达减少,差异具有统计学意义。5.体外Western-blot结果表明,当H2O2引起的损伤发生时,SCDEs处理后,EGFR下调。同时参与自噬调节的phosphor-Akt和phosphor-m TOR的磷酸化水平表达下降。SCDEs处理降低了受H2O2诱导损伤的神经元细胞中Akt和m TOR的磷酸化水平。【结论】本实验通过体内和体外实验表明,SCDEs增强了SCI后自噬的发生并降低了细胞凋亡,进而促进了轴突的再生和运动功能的恢复。此外,本实验发现SCDEs的表达增加导致EGFR的表达降低,并抑制Akt-m TOR信号通路的激活,从而上调了自噬的发生,减少了细胞的凋亡。综上所述,本实验的研究结果表明,SCDEs通过抑制EGFR-Akt-m TOR信号传导途径增加自噬的发生并减少细胞凋亡,从而促进SCI后的轴突再生。