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研究背景： 心血管疾病是危害人类健康的头号杀手，而80-90％心血管疾病患者都伴随着高血压。“阻止高血压饮食计划(DASH)”中重要的一条就是增加水果蔬菜的摄入量。细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为重要的炎症因子，可以诱导内皮细胞表达相应蛋白，能显著增强血管内皮细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞间粘附分子-1(VCAM-1)蛋白和mRNA的表达，促进炎症发生及发展进程。蓝莓作为功能性食品，其果实中花青素的含量很高，具有抗炎症、增强心脏功能、改善血管循环、防止脑神经衰老、明目及抗癌等独特功效。研究发现蓝莓花青素中锦葵色素的含量很高，因此本文以氯化锦葵色素、氯化锦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化锦葵色素-3-半乳糖苷为研究对象，研究它们对TNF-α诱导的体外人脐静脉内皮细胞炎症的保护作用及糖苷协同作用，并从分子基础上研究其作用机制，为心血管疾病的研究提供一定的理论基础。 研究目的: 1. 体外分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，采用TNF-α干预细胞，建立内皮细胞功能损伤所致的炎症模型，观察不同浓度氯化锦葵色素、氯化锦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化锦葵色素-3-半乳糖苷对内皮细胞的保护作用。 2. 采用ELISA、Western Blot及RT-PCR方法检测不同锦葵色素对细胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1的表达情况，探讨它们保护HUVEC的分子机制。 3. 观察细胞中及细胞核中IκBα蛋白表达情况及NF-κB核转录情况，从分子基础上解释不同氯化锦葵色素对HUVEC炎症的保护作用及糖苷协同作用。 研究方法: 1. 采用酶解法体外分离新鲜的婴儿脐带，得到人脐静脉内皮细胞，用M199完全培养基进行培养、传代及冻存;取3-6代人脐静脉内皮细胞进行试验。 2. 采用不同浓度的肿瘤坏死因子TNF-α诱导HUVEC4 h及采用最佳浓度的TNF-α刺激细胞不同时间，取其细胞，分别采用ELISA检测细胞上清中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表达水平;采用Western Blot检测细胞中ICAM-1及VCAM-1蛋白表达水平，根据分析结果确定TNF-α诱导HUVEC最佳剂量及时效。 3. 采用不同浓度的氯化锦葵色素、氯化锦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化锦葵色素-3-半乳糖及选择最佳浓度的糖苷预处理细胞18h，加入10μg/L TNF-α刺激6h，分别采用MTT法检测细胞活力;采用ELISA检测细胞上清中MCP-1及VCAM-1蛋白表达水平;采用Western Blot检测细胞中ICAM-1及VCAM-1蛋白表达水平，采用荧光定量RT-PCR检测细胞MCP-1及VCAM-1 mRNA的表达水平。 4. 采用最佳浓度的锦葵色素糖苷作用细胞，采用Western Blot检测细胞中IκBα蛋白表达变化，采用核转录-转运试剂盒检测细胞质中NF-κB核转录情况，从分子基础上研究抗炎症作用的机制。 研究结果: 1. TNF-α诱导HUVEC表达MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白 正常细胞少量表达MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白，在受到炎症因子TNF-α刺激时，各蛋白的表达量上升。不同浓度TNF-α刺激HUVEC得到细胞上清及细胞，通过ELISA及Western Blot检测MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白呈浓度依赖性变化，低浓度时蛋白表达量不显著，随着浓度增加，蛋白表达量增加，具有显著性，尤其在浓度为10μg/L时，相比对照组MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表达具有显著性意义(P＜0.01)。 采用最佳浓度10μg/L TNF-α刺激细胞不同时间，表达量呈时间依赖性变化;短刺激时间对细胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表达量影响较小，随着刺激时间的增加，表达量亦增长，尤其在刺激时间6h，细胞上清中可溶性MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表达量达到峰值，分别是对照组的3.762±0.041、8.436±0.367、8.554±0.069倍，具有显著性差异(P＜0.01)。细胞中ICAM-1/β-Actin及VCAM-1/β-Actin相对表达分别为对照组的2.268±0.012(P＜0.001)、1.616±0.022(P＜0.01)倍;在刺激时间为6h时，两者蛋白表达量达到峰值。 2. 氯化锦葵色素抑制TNF-α诱导的HUVEC中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白的表达 MTT法检测细胞活力显示:当1、10、50、100μmol/L Mv-Cl、Mv-3-glc-Cl及Mv-3-gal-Cl相比空白组的抑制率为92.6％、87.6％、70.1％、64.8％，92.6％、87.6％、70.1％、64.8％及86.3％、85.1％、70.3％、61.5％，与TNF-α共同作用时，相比TNF-α刺激组具有显著性意义(P＜0.01)，说明Mv-Cl、Mv-3-glc-Cl及Mv-3-gal-Cl不同程度的对内皮细胞具有一定的保护作用，由于浓度的增加，对细胞活力具有一定的影响。 采用ELISA、Western Blot及RT-RCR检测细胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白及mRNA表达情况，正常情况下，正常细胞少量表达MCP-1、ICAM-1及 VCAM-1蛋白及mRNA，当细胞受到炎症因子TNF-α刺激时，三种因子的表达量上升，当不同浓度Mv-Cl(1、10、50、100μmol/L)作用细胞时，蛋白及mRNA的表达量相比TNF-α刺激组具有显著下降，尤其是浓度为50、100μmol/L时，三种因子的抑制率达到90％以上，接近于正常组，说明随着浓度的增加，Mv-Cl对TNF-α诱导的内皮细胞炎症具有保护作用. 3. 氯化锦葵色素-3-O-葡萄糖苷及半乳糖苷抑制TNF-α诱导的HUVEC中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白的表达 通过ELISA、Western Blot及RT-PCR方法检测细胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白及mRNA变化，得出:不同浓度的Mv-3-glc-Cl、Mv-3-gal-Cl对TNF-α引起的炎症反应呈浓度依赖式保护作用。对于细胞中MCP-1及VCAM-1蛋白或mRNA，Mv-3-glc-Cl比Mv-3-gal-Cl抑制效果更明显，但在低浓度刺激时，对于细胞中ICAM-1，Mv-3-gal-Cl比Mv-3-glc-Cl作用效果明显，但随着浓度增加，葡萄糖苷式作用比半乳糖苷式发挥更强的保护作用。 4. 糖苷氯化锦葵色素协同抑制TNF-α诱导的HUVEC中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白的表达及分子机理研究 通过ELISA法及Werstern Blot及RT-PCR检测发现预处理的Mv-3-glc-Cl、Mv-3-gal-Cl和(Mv-3-glc-Cl+Mv-3-gal-Cl)对MCP-1、 ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表达相比单独刺激TNF-α组具有明显的抑制作用，并且具有协同作用。通过Western Blot检测细胞质中IκBα蛋白得出，正常细胞受到TNF-α介导时，IκBα蛋白含量降低，验证了IκBα被降解，从而表达MCP-1，ICAM-1和VCAM-1;而当孵育不同浓度氯化锦葵色素时，IκBα相对降解量相比TNF-α组减少。此外，通过免疫荧光检测NF-κ Bp65核转运情况也得到相应结果，正常细胞NF-κB捕捉的荧光强度很弱。单独TNF-α组NF-κB捕捉的荧光强度最强，随着Mv-3-glc-Cl、Mv-3-gal-Cl和(Mv-3-glc-Cl+Mv-3-gal-Cl)的加入，NF-κB荧光强度相对于对照组渐渐变弱，证实了氯化锦葵色素能阻止NF-κB的激活，起到抑制炎症因子的作用，从而起到抗炎症的作用。