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研究背景与目的原发性肝癌(PHC)是严重危害人类健康的恶性疾病,其死亡率位居各类恶性肿瘤的第二位。造成PHC高死亡率的主要原因是其恶性增殖的特性和易于发生早期转移。癌细胞的增殖和凋亡失衡是其核心环节,侵袭和转移是肝癌细胞的本质特征。肝癌细胞的侵袭和转移首先来源于癌细胞个体的移行,涉及到癌细胞的变形、粘附、细胞外基质降解、多基因激活、转录、调节等复杂的细胞生物学过程。目前研究已经发现癌细胞的移行过程与细胞骨架的变化密切相关。近年来人们发现一类新的细胞因子Rho在调控细胞骨架变化过程中发挥着重要的作用, RhoA因子是Rho家族中的标志性因子,它在人类的很多恶性肿瘤中异常表达,提示其在肿瘤形成中发挥着重要的作用。本课题拟从肝癌生物学特性出发,探讨RhoA在组织和细胞水平对PHC增殖、侵袭和转移中的作用,为进一步研究其生物学行为的内在分子机制提供实验基础。方法收集同济医院外科30例PHC手术切除标本,用RT-PCR和Western- Blot的方法检测癌组织、癌旁组织中RhoA基因mRNA和蛋白表达的相对水平,并通过与病例临床病理特征(性别、肿瘤直径、细胞分化程度、结节数目、有无淋巴结静脉浸润以及有无肝外转移灶)的分析,以探讨RhoA基因在PHC组织增殖、侵袭和转移中的作用。在体外水平,首先用RT-PCR和Western-Blot方法比较RhoA基因在各肝癌细胞系(HepG2、SMMC7721、HepG2.2.15和Hep3B)及正常胚胎肝细胞系LO2中的表达;然后用Pgenesil-2质粒构建RhoAshRNA的真核表达载体和对所有哺乳类基因组无任何干扰效应对照shRNA的真核表达载体;脂质体法分别转染至高表达RhoA的人肝癌细胞系HepG2中;通过筛选得到具有干扰效应的序列载体,将该质粒载体转染到HepG2中,用选择性培养基筛选出稳定低表达RhoA基因的HepG2细胞株及正常表达RhoA基因的对照HepG2细胞株,侵袭小室(transwell)检测这些细胞株的侵袭和迁移能力;并用染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记这些细胞株后,流式细胞仪检测细胞的增殖情况。结果1、PHC癌组织和癌旁组织中均可检测到RhoA基因mRNA和蛋白的表达。RhoA基因mRNA和蛋白水平在PHC癌组织中的表达均较癌旁组织高,其吸光度(A)比值分别为1.45±0.66和1.18±0.53;35.74±2.38和16.50±1.53,差异均具有显著统计学意义(P<0.05)。2、分别以细胞分化程度、结节数目、有无淋巴结静脉浸润以及有无肝外转移灶这些因素对PHC癌组织进行分组比较,RhoA mRNA和蛋白的表达量均具有显著的差异(P<0.05),说明RhoA的表达量与PHC的细胞分化程度、结节数目、有无淋巴结静脉浸润以及有无肝外转移灶有关;而以性别和肿瘤直径分组,RhoA mRNA和蛋白的表达量无显著差异(P>0.05),说明RhoA的表达量与性别和肿瘤直径关联性不大。3、在各肝癌细胞系(HepG2、SMMC7721、HepG2.2.15和Hep3B)中,RhoA mRNA和蛋白的表达水平均显著高于正常人肝胚胎细胞系LO2(P<0.05)。4、成功构建了RhoAshRNA质粒表达载体(pshRNA-RhoA1及pshRNA-RhoA2)及对照载体(pshRNA-HK),并在转染HepG2后,筛选出能够特异性抑制RhoA基因表达的shRNA质粒表达载体(pshRNA-RhoA2)。5、成功建立了稳定低表达RhoA的HepG2细胞株(pshRNARhoA-HepG2)及对照HepG2细胞株(pshRNAHK- HepG2)。6、在侵袭和迁移能力实验中,各组穿膜细胞个数分别为:pshRNARhoA-HepG2组(34.1±3.2/25.2±2.1)、pshRNAHK- HepG2组(62.0±2.8/39.5±1.6)和空白细胞HepG2组(65.3±3.4/41.7±2.9)。可见与HepG2相比,pshRNARhoA-HepG2侵袭和迁移能力均明显下降(P<0.05),而pshRNAHK- HepG2却未有明显变化(P>0.05),提示HepG2细胞中RhoA的表达降低后,侵袭和迁移能力均显著降低。7、RhoAshRNA对肝癌细胞增殖能力的影响:pshRNARhoA-HepG2、pshRNAHK- HepG2和空白细胞HepG2分别用CFSE标记后,流式检测的结果显示, pshRNARhoA-HepG2的增殖系数为40.33,而pshRNAHK- HepG2的增殖系数为61.26,HepG2的增殖系数为66.15。可见与HepG2相比,pshRNARhoA-HepG2的增殖速度明显减慢(P<0.05),而pshRNAHK- HepG2的增殖速度却没有明显变化(P>0.05)。说明HepG2细胞中RhoA的表达降低后,增殖能力明显降低。结论RhoA基因在原发性肝癌组织中和体外肝癌细胞系中均过量表达,并与反映肝癌浸润和转移性的临床病理特征密切相关,抑制肝癌细胞系中RhoA基因的表达后,能降低细胞的侵袭迁移和增殖能力,部分逆转肝癌细胞的恶性表型,为进一步研究肝癌侵袭转移和增殖机制提供了实验基础。此外,RhoA基因有望成为反映PHC侵袭和转移能力的新指标,为肝癌的基因治疗提供理论依据。