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目的:血小板在止血中发挥重要作用,有研究显示其参与肿瘤细胞的血行扩散。大量的血小板在肿瘤血管外的微环境中被检测到。然而,目前尚不清楚是否血管外的血小板与肿瘤细胞的相互作用在肿瘤的生长、血管生成及转移启动中发挥作用。本研究将对血小板是否通过调节肿瘤微环境中的肿瘤细胞迁移进入血管进而增加肿瘤的转移和侵袭展开研究。 方法:1.体外部分:采用改良的3-D迁移实验就血小板对肿瘤细胞的侵袭性进行探讨。B16/F10与血小板按照1:1000的比例混匀,悬浮于matrigel,加入迁移板上层小室,下层24孔板每孔加入DMEM600μL(含2.5％FBS),37℃,5%CO2培养72小时,取出上层小室,以消毒棉签轻轻拭去半透膜上层小腔内的matrigel,半透膜下表面以结晶紫染色,显微镜下计数迁移的肿瘤细胞。每个孔随机取5个视野计数,结果以均数±标准差表示。2.体内部分:(1)移植性肿瘤模型的建立:小鼠以戊巴比妥钠麻醉,1×106B16/F10混悬于基质胶(80%)接种于小鼠背部(已用脱毛膏去毛)(共培养组:血小板与肿瘤细胞1000:1混匀后37℃孵育30min后接种),每3天用游标卡尺测量一次肿瘤大小,肿瘤大小=长×宽2×0.52。小鼠在接种后第24天处死。(2)血小板减少的诱导:待C57小鼠的B16/F10肿瘤大小长至约500mm3,腹腔注射小鼠血小板减少抗体(polyclonalanti-mouseGPIbαratIgG),3天/次,2.5μg/g体重。对照组腹腔注射IgG(nonimmuneratpolyclonalIgG)。以血小板计数来评价血小板减少模型是否建立。(3)微透析:麻醉小鼠,将微透析探针(CMA/20,0.5mmdiameter)插入肿瘤组织,连于CMA/102微透析泵(CMA/Microdialysis),以154mmol/LNaCl(含40mg/mLdextran),速度0.6μL/min进行透析,透析液以冰浴收集,保存于-80℃用于后续实验。(4)肿瘤肺转移的定量:以HE染色石蜡包埋的肺组织,显微镜下观察双肺,计数转移结节,转移面积占全肺的比例以NIHImageJsoftware进行分析。(5)肿瘤缺氧分析:小鼠处死前2h腹腔注射哌莫硝唑(hydro-chochloride),哌莫硝唑复合物将按照厂家的方法使用Hypoxyprobe-1-Mab1抗体进行免疫组化分析。图像以Leica(DM750)显微镜采集。每个标本至少分析3张切片,每张切片3个不同的视野。(6)统计学方法:采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义。 结果:1.血小板与肿瘤细胞共培养促进肿瘤细胞的侵袭能力。在改良的3D侵袭实验中,血小板与肿瘤细胞共培养组较对照组肿瘤细胞的侵袭能力明显增强。2.GPIbα抗体可有效抑制小鼠血小板数量:腹腔注射GPIbα抗体2.5μg/g体重,在注射后12h即可引起小鼠循环中的血小板数量减少95%以上。小鼠每3天注射1次抗体可维持血小板减少状态。3.减少血小板不改变肿瘤大小,但降低肿瘤肺转移:在接种后第24天,与对照组相比,血小板减少组肿瘤大小(2777±300mm3Vs.2956±180mm3,P>0.05)和肿瘤重量(4.204±0.67gVs.3.943±0.63g,P>0.05)均无明显改变,但进一步检查双肺转移情况发现肺转移明显减少。4.减少血小板明显减少肿瘤血管密度和降低血管成熟性:由于血小板释放颗粒释放的促血管生成因子可能影响肿瘤血管形成,我们使用anti-PECAM-1和anti-α–SMA双染法检查了肿瘤组织血管密度和覆盖率。血小板减少组的PECAM-1-positive毛细血管密度明显低于对照组。肿瘤内的毛细血管覆盖率(α–SMA-positive的壁细胞)亦明显少于对照组。5.减少血小板降低肿瘤缺血和HIF-1α表达:为了更好地探寻血小板减少导致肿瘤转移的分子机制,我们首先通过检查肿瘤组织中哌莫硝唑复合物的生成评价了缺氧水平,结果显示血小板减少组的缺氧明显低于对照组。此外,缺氧诱导的转录因子HIF-1α表达明显低于对照组。6.血小板与肿瘤细胞共培养促进肿瘤生长和肿瘤转移:血小板与肿瘤细胞B16/F10以1000:1的比例混悬共培养(37℃,5%CO2)30min后接种于小鼠背部,同时设未共培养的对照组。待肿瘤生长24天后,共培养组的肿瘤大小(3968±296mm3Vs.2956±180mm3,P<0.05)和肿瘤重量(5.529±0.35gVs.3.943±0.74g,P<0.05)明显大于对照组,且肿瘤的肺转移明显增加。通过检查肿瘤组织中哌莫硝唑复合物的生成评价了缺氧水平,结果显示共培养组的缺氧明显高于对照组。7.血小板改变肿瘤内的血管生成因子水平:在处死小鼠的前一天对肿瘤组织进行微透析,透析液以VEGF-Elisa试剂盒进行定量分析,结果显示血小板减少组的VEGF明显低于对照组(P<0.05)。 结论:1.血小板促进肿瘤细胞的迁移,即增强肿瘤细胞的侵袭性。2.血液循环中的血小板在肿瘤的生长和侵袭中扮演了重要角色,不改变肿瘤的大小,但是促进肿瘤转移。3.肿瘤微环境中血小板与肿瘤细胞的粘附增加肿瘤的生长和转移。4.血小板减少改变肿瘤微环境中血管的数量和成熟度。5.血小板可能参与了肿瘤缺血,血小板数量的减少使转录因子HIF-1α表达下调。6.血小板可能参与了肿瘤微环境血管生成因子的分泌。