DNA磷硫酰化是首例发现于DNA骨架上的修饰,其主要由dndABCDE五个基因编码的蛋白负责,将DNA非桥联氧原子替换为硫原子,形成具有序列特异和空间结构专一(Rp)等特征的新型修饰。目前DNA磷硫酰化系统仅发现于原核生物中且主要包含两种类型。其中Ⅰ型的典型代表是最先用于研究该领域的变铅青链霉菌,由上述五个基因负责产生在DNA双链上均有的修饰;Ⅱ型为近几年研究所发现,由sspABCD基因簇编码对DNA单链进行高频率修饰,比如弧菌FF75。长期研究发现,一些具有Ⅰ型系统的细菌中,其dndBCDE下游存在限制基因dndFGH,连同修饰基因簇形成特殊调控的限制-修饰系统,以保护宿主免受外源DNA(无硫修饰)的侵扰。对于Ⅱ型修饰系统的研究仍在努力探索中。本研究通过质谱检测发现在棒状链霉菌ATCC 27064中存在与弧菌FF75相同的Ⅱ型磷硫酰化修饰—d(CPSC)Rp。通过进一步基因比对寻到负责该修饰的四个基因sspABCD,并通过异源表达检测到修饰信号得以确认。在SspA蛋白晶体的基础上,结合同源比对和晶体解析结果,获知蛋白表面存在三个最为保守的螺旋区域,分别将这三个保守区域进行全突变和一系列点突变,发现磷硫酰化修饰信号消失或修饰量有不同程度下降,证实SspA在修饰途径中的重要性。蛋白结构比对获知SspA具有与FokI和N.BspD6I相似的核酸酶功能,体外研究证明在多数二价离子条件下,SspA对超螺旋DNA进行非特异切割,Mn2+和Mg2+中活性尤其显著,而Zn2+和高浓度Cu2+能够抑制该蛋白活性。以线性DNA和寡聚核苷酸DNA为底物,观察到相同的结果进一步证实了蛋白的非特异核酸酶活性。对SspA与Mn2+的共晶解析发现E18是离子结合位点,突变为精氨酸后严重影响切割活性,证实了二价金属离子对蛋白核酸酶活性的必要性。此外,SspA与FokI的形态极为相似,蛋白晶体结构显示其为二聚体状态,而在水溶液中的存在形式为单体。对介导SspA二聚体形成的主要作用力进行分析,将关键位点Y103/F24、E204分别突变,使得切割活性完全丧失。本文应用SMRT三代测序手段对棒状链霉菌进行序列分析,为基因组的硫修饰精准定位提供了重要依据。最后对负责二型修饰蛋白间的相互关系进行探究,检测到SspB与SspC、SspB与SspD之间可能存在相互作用,结果正进一步确定中,这为之后硫修饰的生化途径探索提供了强有力的理论基础。本课题致力于Ⅱ型磷硫酰化系统的研究,为DNA磷硫酰化新型修饰的形成机理探究奠定了坚实的基础。