乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其增殖与转移是造成患者死亡的最主要原因。癌的增殖和转移是多基因、多因子及多步骤共同作用的结果,其中癌细胞获得高复制能力和高迁移能力是癌细胞不断增生和向远处转移的重要步骤。在癌细胞增殖和侵袭过程中,细胞需要获得特殊的信号途径调控肿瘤细胞迁移。本论文主要研究了乳腺癌中乙肝病毒X蛋白结合蛋白(Hepatitis B X-interacting protein, HBXIP)通过S100A4促进乳腺癌增殖与转移的体内外机制,以及癌基因DEK异常表达与乳腺癌临床生物学行为之间的关系,并初步验证了DEK基因在乳腺癌增殖过程中的作用。哺乳动物乙肝病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)是一种保守的细胞组成型蛋白,其分子量约18kD,最初因与乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus x protein, HBx)结合而被发现和命名。前期研究发现,HBXIP具有促进乳腺癌细胞增殖和迁移的作用。应用组织芯片进行免疫组化检测后发现,HBXIP在乳腺癌中明显高表达,并与乳腺癌转移成正比,但其分子机制尚不清楚。S100A4是近年发现的癌基因,与肿瘤细胞的增殖、迁移和肿瘤转移密切相关。为了进一步探讨HBXIP和S100A4在乳腺癌发病中的关系,本研究应用具有不同增殖和迁移能力的乳腺癌细胞系对HBXIP促进乳腺癌增殖与迁移的分子机制作了深入研究,发现HBXIP和S100A4蛋白在乳腺癌中的阳性表达率明显增高,且与乳腺癌转移呈明显的正相关。Real-time PCR及Western blotting等检测结果显示,在乳腺癌高增殖或高迁移能力的细胞系LM-MCF-7/MDA-MB-231中HBXIP与S100A4均明显高表达,而在低增殖和低迁移能力的MCF-7和T47D细胞中二者的表达水平均较低,提示HBXIP和S100A4与乳腺癌细胞的增殖和迁移具有相关性。通过过表达或干扰HBXIP,检测其对S100A4表达的影响,发现HBXIP可明显上调S100A4的mRNA和蛋白水平的表达,MTT,EdU,wound healing等功能实验结果也进一步证实HBXIP主要通过上调S100A4的表达促进乳腺癌细胞的增殖和迁移。为进一步研究HBXIP上调S100A4的分子机制,我们首先通过应用免疫组化技术,发现HBXIP在部分乳腺癌细胞核中表达较高,在HBXIP阳性的乳腺癌组织中,S100A4的表达水平也明显上调,提示HBXIP除了在细胞质中通过信号转导途径调节靶基因转录之外,也可能在细胞核中对S100A4的启动子具有直接转录调控作用。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验证实,HBXIP与S100A4启动子区结合,提示HBXIP可直接启动S100A4的转录。分段克隆S100A4启动子基因后,双荧光素报告基因实验发现,HBXIP对S100A4的启动子活性具有明显的增强作用,应用TF-search软件预测分析,在该结合区域存在潜在的转录因子STAT-4的结合位点：通过干扰STAT-4以及克隆STAT-4缺失的突变体,证实HBXIP可通过STAT-4调节S100A4的转录。根据文献报道HBXIP可以激活PI3K/AKT通路,而S100A4是该通路的靶基因,我们设想HBXIP有可能通过PI3K/AKT通路,间接促进S100A4表达。通过应用PI3K/AKT通路抑制剂Wortmannin,甲基化抑制剂5-Aza,过表达PI3K/AKT通路中关键调节基因PTEN等方法发现,HBXIP还可通过增加PTEN甲基化激活PI3K/AKT通路,进而上调S100A4的表达。动物成瘤实验进一步证实,HBXIP通过上调S100A4的表达水平促进乳腺癌的生长,这将为乳腺癌靶向治疗提供可能的新靶点。DEK由375个氨基酸组成,主要位于细胞核常染色质内,可以促进DNA损伤的修复,与染色质重构及基因转录有关,国内外研究报道提示DEK蛋白可能通过抑制细胞凋亡、刺激细胞增殖促进肿瘤的发生发展,但DEK蛋白在乳腺癌中的表达特点和意义尚罕见报道。在前期研究中,我们发现DEK基因可以作为一种新的肿瘤标记物,与不同肿瘤的发生发展有密切联系,例如宫颈癌,卵巢癌等。本研究旨在探讨DEK蛋白与乳腺癌临床特征之间的关系并初步研究DEK基因参与乳腺癌进展的分子机制。我们利用免疫组化方法在262例乳腺标本中检测了DEK蛋白的表达情况,并结合临床资料和体外分子生物学实验,初步验证了DEK基因和蛋白表达检测可作为一种新的乳腺癌辅助检测指标,在乳腺癌预后评估和靶向治疗中具有重要的意义。对262例选自延边肿瘤医院病理科的乳腺病变标本(包括25例正常乳腺组织,16例乳腺增生组织,40例乳腺原位导管内癌(DCIS)以及181例浸润性乳腺癌)进行DEK,ER,PR,Ki-67蛋白等免疫组化检测,结果发现：与周围正常乳腺组织(DEK蛋白阳性率为16.0%)相比,DEK在乳腺导管内癌中的阳性率较高(阳性率为85.0%)；同时,与正常乳腺组织相比,浸润性乳腺癌中DEK蛋白的阳性率明显增高(阳性率为96.0%)；而在乳腺增生组织中,DEK蛋白仅表现为阴性或者弱阳性表达(阳性率为18.8%)。结合临床资料可以发现,DEK蛋白的表达与肿瘤患者的临床生物学特点密切相关。Ki-67是目前临床上比较公认的肿瘤增殖指标,DEK蛋白在40例Ki-67阴性的乳腺癌组织中,阳性率仅为12.5%,而在141例Ki-67阳性的乳腺癌组织中,DEK的阳性率高达91.7%,提示DEK可能与Ki-67同样是肿瘤细胞增殖的指标之一。同时,在不同分期乳腺癌标本中,DEK在G1期乳腺癌中阳性率为39.6%,明显低于G2期(92.3%)和G3期(97.0%)(P<0.05).此外,DEK蛋白在临床分级为Stage-0和Stage-Ⅰ的早期乳腺癌组织中,阳性率分别为21.4%和40.9%,与临床分级为Stage-Ⅱa(87.5%),Stage-Ⅱb(89.7%)及Stage-Ⅲa(92.3%)相比具有显著差异(P<0.05)。同时,DEK蛋白的表达与肿瘤患者的预后也有一定的关系,在对乳腺癌患者进行随访后发现,DEK蛋白在生存率小于三年的患者标本中,DEK阳性表达率明显高于随访三年后仍健在的患者标本,提示DEK的表达情况也可以在一定程度上预测患者预后。此外,我们的实验结果还发现：DEK与乳腺癌其他相关蛋白ER、PR的表达无明显相关性,有待深入研究。为进一步探讨DEK参与乳腺癌发展的分子机制,我们首先检测了DEK在不同乳腺癌细胞系中的表达情况,结果发现,在MCF-7,MDA-MB-231,SKBR3,BT549以及T47D中,DEK在mRNA水平上均有表达。利用免疫荧光染色方法,我们首先在细胞内在细胞水平验证了DEK蛋白的定位,在乳腺癌MCF-7细胞系中,DEK蛋白与Ki-67蛋白均主要位于细胞核内,与免疫组化结果相符,但有趣的是：当利用siRNA干扰DEK表达后,Ki-67的表达也有一定程度的减少,提示二者可能存在相关性,但尚需进一步实验证明。功能试验发现：干扰DEK表达后,乳腺癌细胞MCF-7的增殖能力明显下降,流式细胞术结果也显示,DEK基因沉默后,乳腺癌细胞MCF-7的早期凋亡明显增加。有关DEK参与乳腺癌发展的分子机制有待进一步的研究证实。以上结果提示,DEK与乳腺癌的演进密切相关,有可能成为新的乳腺癌增殖指标,可以为患者肿瘤增殖能力和预后评估提供参考,并有可能成为乳腺癌治疗的新分子靶点。