目的:脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemic-reperfusion injury,SCIRI）在临床中与胸、腹主动脉等大血管相关手术相关的最严重的并发症之一,它能够导致脊髓损伤节段以下的感觉和运动功能障碍。这种情况的发生会给患者本人、家庭成员和社会带来巨大的精神心理和经济负担。现有研究表明SCIRI可以通过多种作用机制来对神经功能造成不利影响,但目前研究认为,SCIRI的作用机制较复杂并且尚未完全被了解。研究SCIRI的病理机制可以为促进SCIRI后神经功能的恢复做出贡献。细胞凋亡和炎症反应对SCIRI起到非常主要的作用,是SCIRI的主要机制,而且神经元的死亡是不可逆转的。脊髓内神经元的损伤是导致下肢运动的功能障碍和感觉障碍的原因,有挑战性的是在SCIRI后神经修复与损伤区的功能恢复。非编码RNA是一类没有编码作用的RNA,在既往研究中证明,非编码RNA参与多个器官病理生理功能包括缺血再灌注损伤的调节。近年来,逐渐增多的证据表明,在中枢神经系统疾病中,非编码RNA发挥着越来越重要的作用。有基因芯片研究结果提示在SCIRI后有lnc RNA和micor RNA水平的改变,结合现有研究结果可证实有lnc RNA和micro RNA参与SCIRI相关机制的调节。lnc RNA TUG1是最早发现的与人类疾病相关的lnc RNAs之一,它积极参与多种生理病理过程,包括神经系统疾病。近期一项研究表明,TUG1基因敲除可以防止神经元死亡,从而减轻急性脊髓损伤。mi R-9a-5p被证实参与多种疾病过程的调节,包括神经系统疾病。DIAPH1是formin家族的一员,它可以与晚期糖基化终产物受体（RAGE）的胞质结构域结合,介导RAGE受体的细胞内信号转导,DIAPH1对RAGE配体调节相关细胞功能和细胞内信号转导的起着非常重要的作用。在本研究中,我们探索了lnc RNA TUG1对SCIRI的作用以及其通过竞争性内源性RNA机制结合mi R-9a-5p靶向调节DIAPH1,从而影响神经细胞的凋亡。研究方法:1、建立SCIRI模型,主动脉弓在左锁骨下动脉近端夹闭14分钟。通过q RTPCR和western blot实验检测mi R-9a-5p和DIAPH1在SCIRI后12 h、24 h、48 h、72h的表达水平。基于以上实验得出的结果,我们选择SCIRI后的研究时间点。通过术前连续三天鞘内注射mi R-9a-5p的模拟物（mimic）和mi R-9a-5p抑制物（inhibitor）对mi R-9a-5p进行上调和抑制表达。mi R-9a-5p相对表达量采用q RT-PCR检测。Tarlov评分检测SCIRI后和mi R-9a-5p mimic和inhibitor鞘内注射后下肢运动功能评分。HE染色观察脊髓前角运动神经元的结构改变和计数。通过双荧光素酶报告基因实验验证mi R-9a-5p和DIAPH1的靶向结合关系。采用Tarlov评分系统和Td Tmediated d UTP Nick-End Labeling（TUNEL）实验评价神经功能和神经元凋亡。western blot检测凋亡因子Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和通路蛋白NF-κB p65及其磷酸化形式p-NF-κB p65蛋白表达水平。采用免疫荧光染色法检测DIAPH1和神经元细胞的共定位,并观察DIAPH1的荧光强度改变。2、q RT-PCR检测不同时间点lnc RNA TUG1和mi R-9a-5p的RNA相对表达水平。基于以上结果,我们选择SCIRI后的lnc RNA TUG1和mi R-9a-5p损伤最严重的时间点。双荧光素酶报告基因实验验证lnc RNA TUG1和mi R-9a-5p的直接结合关系。通过术前连续三天鞘内注射小干扰RNA（si RNA）对lnc RNA TUG1进行沉默,之后q RT-PCR检测lnc RNA TUG1的表达水平验证si-TUG1的沉默效果,Tarlov评分检测沉默TUG1后大鼠下肢运动功能。HE染色检测沉默lnc RNA TUG1后脊髓前角运动神经元细胞的结构和计数。q RT-PCR验证沉默lnc RNA TUG1后对脊髓mi R-9a-5p表达水平的影响。3、通过术前连续三天鞘内注射si RNA沉默lnc RNA TUG1。利用q RT-PCR和western blotting检测Sham组、SCIRI组、NC组和si-TUG1组中DIAPH1、凋亡因子Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、通路蛋白NF-κB p65及其磷酸化形式p-NF-κB p65蛋白表达水平。在Sham组、SCIRI组、NC组和si-lnc RNA TUG1组中,采用免疫荧光染色法检测DIAPH1和神经元细胞的共定位,并观察DIAPH1的荧光强度改变。采用Tarlov评分系统评估下肢运动功能,TUNEL实验检测神经元凋亡。结果:1、mi R-9a-5p在SCIRI后24h和48h显著降低,DIAPH1在SCIRI后48h升高,双荧光素酶报告基因结果显示,mi R-9a-5p可以和DIAPH1的3’UTR区的预测位点直接结合。mi R-9a-5p mimic术前连续3天鞘内注射后,与IR组相比,mi R-9a-5p水平明显升高,Tarlov评分结果显示大鼠下肢运动功能改善,HE染色可以观察到形态结构完整的神经元数目增多,DIAPH1蛋白含量明显降低,同时凋亡因子Bax和cleaved caspase-3水平明显下降,Bcl-2水平上升,磷酸化NF-κB p65的相对水平表达降低。免疫荧光双标结果提示,DIAPH1可以与神经元标志Neu N共定位,与Sham组相比,IR组和NC组的DIAPH1相对荧光值明显升高,与IR组相比mi R-9a-5p mimic组的相对荧光值下降。IR组的TUNEL阳性细胞比率,明显高于Sham组,与IR组相比,mi R-9a-5p mimic的TUNEL阳性细胞比率有所降低。2、lnc RNA TUG1的RNA表达水平在脊髓缺血再灌注损伤后48小时增高。mi R-9a-5p的RNA表达水平在脊髓缺血再灌注损伤后48小时显著降低。二者之间存在相关性。鞘内注射si-TUG1后,脊髓lnc RNA TUG1含量明显下降。与IR组相比,鞘内注射si-TUG1后,Tarlov评分增高,HE染色结果可以观察到形态完整的神经元数目增多。双荧光酶素报告基因结果显示lnc RNA TUG1可以与mi R-9a-5p直接结合,鞘内注射siTUG1后,脊髓lnc RNA TUG1含量下降,同时沉默lnc RNA TUG1可以起到调节mi R-9a-5p水平升高的作用。3、沉默lnc RNA TUG1后,DIAPH1的m RNA表达水平显著增高,同时WB结果也显示在沉默lnc RNA TUG1后DIAPH1的蛋白表达水平也增高,凋亡因子Bax和cleaved caspase-3水平明显下降,Bcl-2水平上升,磷酸化NF-κB p65的相对水平表达降低。免疫荧光结果显示,与Sham组相比,IR组和NC组的DIAPH1相对荧光值明显升高,与IR组相比si-TUG1组的相对荧光值下降。在TUNEL实验中,与Sham组相比IR组凋亡细胞数量明显增多,而si-TUG1组凋亡细胞比率较IR组有明显下降。结论:在SCIRI的过程中,mi R-9a-5p与DIAPH1存在直接结合,鞘内注射mi R-9a-5p mimic后,可以抑制DIAPH1的水平,缓解细胞凋亡,改善大鼠下肢运动功能。lnc RNA TUG1与mi R-9a-5p存在竞争性抑制关系,沉默lnc RNA TUG1可通过上调mi R-9a-5p水平,从而抑制DIAPH1,通过NF-κB通路,减轻SCIRI后神经凋亡反应,从而缓解大鼠下肢运动功能障碍。