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目的:通过构建不同组合的人源化肝细胞二维共培养体系,从细胞活性及主要细胞色素酶基因表达层面比较不同共培养体系作为代谢活化系统的优越性,并通过体外微核试验对优势共培养体系的代谢活化能力进行初步的验证,为人源化细胞共培养代谢活化系统在遗传毒性试验和致突变性试验中的应用提供理论基础和技术支持。方法:1.共培养模型的构建及细胞生长状态的观察与测定:应用穿孔法制作共培养6孔板。选择人肝癌HepG2/C3A细胞、人结直肠腺癌Caco-2细胞、人肾小管上皮HK-2细胞、人脐静脉内皮HUVEC细胞、人肝星形LX-2细胞作为共培养模型构建的待选细胞系。分别设置各细胞的单独培养组,四种双细胞共培养组 HepG2/C3A-Caco2(CL)、HepG2/C3A-HK2(CH)、HepG2/C3A-HUVEC(CU)和 HepG2/C3A-LX2(CL),以及六种三细胞共培养组HepG2/C3A-Caco2-HK2((COH)、HepG2/C3A-Caco2-HUVEC(COU)、HepG2/C3A-Caco2-LX2(COL)、HepG2/C3A-HK2-HUVEC(CHU)、HepG2/C3A-HK2-LX2(CHL)和HepG2/C3A-HUVEC-LX2(CLU)。每组设置3个重复。培养基联通后连续培养4d,观察细胞生长情况并应用CCK-8法测量细胞生长情况。单独培养组和共培养组处理一致。2.HepG2/C3A细胞主要代谢活化相关酶基因表达情况:将连通后的共培养组细胞及单独培养细胞继续培养24h后收获细胞,加入裂解液进行裂解提取RNA。在不同共培养模型及单独细胞培养模型中,用RT-qPCR方法测量不同模型中的HepG2/C3A细胞的主要I相代谢酶CYP3A4、CYP2E1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9 以及主要Ⅱ相代谢酶 GSTA1/2 和UGT1A1的表达情况。3.优势共培养代谢活化模型的微核试验初步验证:选取细胞生长状态良好、主要P450代谢酶基因表达水平升高的共培养模型作为代谢活化系统。以体外胞质分裂阻滞微核试验验证模型的代谢活化效能。用典型需要代谢活化的致突变阳性物环磷酰胺(9.5、19和38μg/ml)和不需代谢活化的致突变阳性物甲磺酸乙酯(0.325、0.65和1.3μg/ml)进行染毒,设置空白对照和溶剂(超纯水和DMSO)对照组,试验操作与染毒组一致。滴片后用吉姆萨进行染色,计数1000个双核细胞的微核细胞数。结果:1.共培养模型的构建及细胞生长状态的观察与测定:细胞接种24h后贴壁生长,加培养基连通共培养孔,连续观察4d,细胞生长状况良好,显微镜观察共培养细胞与单独培养细胞的形态均未发生显著变化。培养后2、3、4d的生长情况结果显示:在双细胞共培养模型中,除HepG2/C3A-HK2共培养模型中HK2细胞出现生长抑制,其余三种双细胞共培养模型在共培养2d及4d,细胞生长活性与单独培养的细胞差异无统计学意义(P>0.05)。在三细胞共培养模型中,除HepG2/C3A-HUVEC-LX2共培养模型中各细胞与单独培养时生长情况的差异无统计学意义(P>0.05),其余各培养组在培养第3d或第4d,其共培养模型细胞活性显著大于单独培养模型中的活性(P<0.05)。2.HepG2/C3A细胞主要代谢活化相关酶基因表达情况:Ⅰ相代谢酶基因表达水平在不同模型中差别较大。CYP1A2基因在HepG2/C3A-HUVEC、HepG2/C3A-Caco2-HUVEC 和 HepG2/C3A-Caco2-LX2 共培养组中的相对表达量较单独培养组高,分别为单独培养组的6.54、2.34、3.42倍,差异有统计学意义(P<0.05)。CYP2B6基因在HepG2/C3A-HUVEC共培养组表达量升高,为单独培养组的1.47倍,差异有统计学意义(P<0.05)。CYP2C9基因在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养组相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的4.2倍,差异有统计学意义(P<0.05)。CYP2E1基因 在 HepG2/C3A-Caco2、HepG2/C3A-HK2、HepG2/C3A-LX2、HepG2/C3A-HUVEC 和 HepG2/C3A-HUVEC-LX2 共培养组中的相对表达量较单独培养组高,分别为单独培养组的1.63、1.33、1.85、1.62、3.4倍,差异有统计学意义(P<0.05)。CYP3A4基因在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养组中的相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的2.88倍,差异有统计学意义(P<0.05)。UGT1A1基因在 HepG2/C3A-HK2、HepG2/C3A-Caco2-HUVEC 和 HepG2/C3A-Caco2-LX2 共培养组中的相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的2.27、4.40、4.75倍,差异有统计学意义(P<0.05)。GSTA1A2基因在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养组中的相对表达量较单独培养组高,为单独培养组的5.11倍,差异有统计学意义(P<0.05)。3.优势共培养代谢活化模型HepG2/C3A-Caco2-LX2的微核试验初步验证:不需要代谢活化的致突变阳性物甲磺酸乙酯染毒后,单独培养组的微核率分别为16‰、15‰、16‰,共培养组微核率分别为14‰、16‰、15‰,二者的微核率无明显差异(P>0.05)。环磷酰胺共培养组微核率(21‰、18‰、16‰)明显高于单独培养组(微核率12‰、13‰、12‰),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.双细胞共培养模型对细胞的生长状况影响较小,三细胞共培养模型中HepG2/C3A-HK2-Caco2共培养模型和HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养模型的细胞生长活性优于各细胞的单独培养模型,且生长稳定,有望成为稳定的共培养体系。2.HepG2/C3A细胞在HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养模型中主要的Ⅰ相及Ⅱ相代谢酶基因表达升高。3.以HepG2/C3A-Caco2-LX2共培养模型作为代谢活化系统能够在不加入S9的情况下验证致突变阳性物环磷酰胺的致突变性。