已经证实缺血预适应有心肌保护作用，并且在不同种属的在体心、离体灌注心和心肌培养细胞中得到证实。经典IPC机制认为，亚致死的损伤刺激造成内源性保护介质释放，这些介质作为第一信使通过G蛋白偶联受体(GPCR)激活胞内以PKC活化为中心的细胞保护通路，从而启动细胞本身固有的保护作用，伴随应激启动的儿茶酚胺物质也可作为第一信使协同保护，那么，应激反应只是附带的协同了这种机制，还是整体上积极的参与或者主导了IPC作用?本研究首次将应激系统从IPC中分离出来以期分别考察应激和细胞内部固有保护通路各自在心肌保护中的作用。实验分以下四个部分：第一部分去应激缺血再灌注动物模型的建立目的：考察依托咪酯对应激反应的削弱作用及其循环稳定性，建立药物去应激动物模型。方法：24只日本大白兔随机分为4组(n=6)：1) IPC组；2)依托咪酯一次剂量组；3)依托咪酯两次剂量组；4)对照组。实验中监测心率及平均动脉压变化，同时多时点采血测血浆皮质醇浓度。结果：依托咪酯两次剂量组(DOSE2)组平均动脉压基本在90-118mmHg之间，心率在165±31 beat／min-192±23 beat／min之间，T3-T8各时间点血浆皮质醇浓度依托咪酯两次剂量组(DOSE2)与IPC组比较，P＜0.05。结论：依托咪酯二次剂量组明显钝化皮质醇反应，并能保持心率、平均动脉压的相对稳定。第二部分应激系统对心肌缺血预适应保护作用的影响目的：考察削弱了应激反应的缺血预适应心肌保护作用的变化。方法：30只家兔随机分为5组，缺血预适应组(IPC)；缺血再灌注组(IR)；依托咪酯组(Etom)；甲基强的松龙组(MP)；对照组(control)。以心肌梗死面积／缺血面积、血清肌酸激酶(CK)活性和血清肌钙蛋白I(cTnI)浓度为检测指标，同时检测血清皮质醇动态变化。结果：IPC组、Etom组、IR组和MP组和control组心肌梗死面积／缺血面积分别为5.9％±2.8％，11.3％±3.6％，26.8％±4.5％，18.2±3.7％，CK活性增高值(U／L)分别为255±89，768±404，855±371，314±160，120±41，cTnI增高值(μg／l)分别为3.6±0.6，6.4±1.6，8.1±3.6，6.1±2.2，1.8±0.2。Etom组与IPC组比较，各指标均有统计学意义(P＜0.05)。结论：钝化皮质醇反应可明显削弱IPC的保护作用，提示IPC保护作用中可能有应激反应的参与。第三部分应激系统对缺血预适应心肌细胞凋亡的影响目的：考察削弱了应激反应的缺血预适应心肌细胞凋亡的变化及其分子机制。方法：实验分组同第二部分，以DNA ladder、TUNEL染色、Hoechst染色考察心肌细胞的凋亡程度。用免疫组织化学方法显示bcl-2和bax在细胞内的表达。结果：Etom组DNA ladder显示的条带比IPC组明显增多，TUNEL染色计算的凋亡率分别为IPC组1.7％±0.2％，MP组2.3％±0.8％，IR组3.8％±1.3％，Etom组3.0％±0.4％。Hoechst染色计算的凋亡率分别为IPC组3.5％±0.4％，MP组4.1％±0.9％，IR组7.6％±0.4％，Etom组6.2％±1.6％。两种方法所测凋亡率Etom组与IPC组比较差异均有统计学意义，MP组与IR组比较差异有统计学意义。免疫组化染色显示IPC组、Etom组、IR组、MP组的bcl-2／bax比值，以积分光密度比值测量分别为0.597±0.047，0.178±0.030，0.146±0.181，0.168±0.021；以阳性面积比比值测量分别为0.740±0.102，0.251±0.055，0.197±0.048，0.213±0.023。Etom组与IPC比较差异均有统计学意义，MP组与IR组比较差异没有统计学意义。结论：钝化应激反应可削弱IPC的细胞凋亡抑制作用，其机制可能是通过削弱IPC的Bcl-2／bax上调表达作用实现的，甲基强的松龙可抑制缺血再灌注损伤的心肌细胞凋亡，但可能与bcl-2／bax表达无关。第四部分应激系统对IPC的PKC膜向迁移的影响目的：考察削弱应激反应对PKC膜向迁移的影响。探究应激反应影响缺血预适应保护作用的分子机制。方法：实验分4组(n=6)：1) IPC组，2)缺血再灌组(IR)，3)依托咪酯组(Etom)，4)甲基强的松龙组(MP)。均在原拟缺血30min的缺血期进行到10min时采集心脏标本，分离胞膜胞浆蛋白组分，分别用酶活性和蛋白印迹检测PKC的膜向迁移程度。结果：Etom组、IPC组、IR组和MP组的PKC膜向迁移指数以酶活性检测的分别为0.32±0.06，0.38±0.04，0.25±0.03，0.29±0.03；以western-blotting测定的分别为0.49±0.08，0.58±0.06，0.47±0.06，0.50±0.04，Etom组与IPC组比较差异具有统计学意义，MP组与IR组比较差异没有统计学意义。结论：IPC可促使PKCε膜向迁移，削弱了应激反应使PKCε膜向迁移减少，应激促进PKCε的膜向迁移从而协同缺血预适应保护作用可能是它的分子机制之一。甲基强的松龙的心肌保护作用可能与PKCε膜向迁移无关。总结：钝化皮质醇反应可明显削弱IPC的保护作用，削弱应激的促PKCε膜向迁移从而减弱缺血预适应保护作用可能是它的分子机制之一。钝化应激反应可削弱IPC的细胞凋亡抑制作用，其机制可能是通过削弱IPC的Bcl-2／bax上调表达作用实现的。创新点：1、从应激功能和整体水平拓展经典的IPC理论，首次将应激系统在缺血预适应心肌保护中的作用分离出来，并研究了其可能的分子机制。将缺血预适应的机制从理论上进一步拓展，经典的缺血预适应理论可能也是应激系统的细胞反应部分。2、非手术法去应激动物模型的建立。依托咪酯药物去应激动物模型的建立为基础和临床研究提供简单可靠的研究工具。展望：这一理论上的创新可能为心肌预适应方式的选择提供一种新的思路，预适应发现已有30年历史，但迟迟不能在临床上应用，主要原因就在于预适应缺血损伤的直观性和其保护作用的间接证据性，因此，如果绕过预适应中缺血损伤操作，行各种模式的应激激发干预，或者药物对应激的两大核心反应轴进行调制模拟出应激，如果起到保护作用，其临床推广可行性相对较好，寻求预适应保护可能只是寻求合适的应激模式。不足：离体灌注心和心肌细胞培养的IPC证明细胞固有保护通路可不依赖应激参与而存在，但要研究应激对IPC的影响只能用在体心脏，在体心完全屏蔽掉下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴和交感肾上腺轴理论上不可能实现，依托咪酯抑制了应激反应下丘脑—垂体前叶—肾上腺皮质轴的主要产物皮质醇，对交感肾上腺轴几乎没有影响，事实上只相当于抑制了应激反应的部分功能，所以本课题题目定为皮质醇对IPC保护作用的影响似乎更为妥贴，但考虑到皮质醇是应激反应激素网络的最重要的成分，理论上讲，打破了应激反应各组分的平衡应该对应激造成很大干扰，从功能上讲，事实上对应激反应造成了负面影响，并且，本课题重心在于应激对IPC的影响，下丘脑—垂体前叶—肾上腺皮质轴作为应激的重要成分应归结于应激主题。本课题的意义在于启发我们从应激功能的角度全新的认识缺血预适应。