表达鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株S和N蛋白的重组杆状病毒的构建

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鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起鸡的一种高度接触性传染病,给世界养禽业造成了巨大的经济损失。IBV基因组易发生变异和重组,从而产生多种血清型或变异型。临床上用于预防IB的常规疫苗即弱毒苗和灭活苗在效果、安全和成本方面都存在缺陷,因此研制高效、安全、廉价的新型疫苗显得非常重要。IBV结构蛋白中S1和N蛋白是主要免疫原,分别在体液免疫和细胞免疫中发挥重要作用,因此研发包括S1和N蛋白的新型疫苗具有良好的应用前景。昆虫杆状病毒表达系统作为一种成熟的表达系统,在外源蛋白的表达中具有重要的作用,该系统具有良好的翻译后加工能力,可以对重组外源蛋白进行信号肽剪切、糖基化修饰等。相关研究表明,应用杆状病毒表达系统时引入昆虫细胞能识别和剪切的蜂素(Honeybee melittin,HBM)信号肽能够介导外源蛋白以分泌表达的形式存在于培养上清,同时能够增强重组蛋白的表达量及糖基化修饰,表达的重组蛋白更接近天然构象。目前杆状病毒表达系统在IBV的应用只是对单个蛋白进行表达,尚没有对S1和N蛋白进行共表达的研究,并且表达产物在分子量大小、生物活性和分泌性表达方面往往存在缺陷。因此分泌表达结构和功能接近于天然蛋白的S1和N蛋白非常重要。本研究应用昆虫杆状病毒表达系统对广西优势血清型代表性毒株GX-YL5的S1和N蛋白进行单表达或共表达的研究,引入了昆虫细胞可识别的HBM信号肽,并在C端融合6个组氨酸标签和TEV蛋白酶切位点以利于后期蛋白的纯化。具体如下:一、扩增IBV的N基因和HBM信号肽,融合扩增获得HBM-N,克隆后经PCR、酶切和测序验证后,定向亚克隆至双元转座载体pFastBacDual,转化DH1OBac进行转座后筛选纯化获取含有HBM-N基因的重组杆粒rHBM-N。二、扩增HBM信号肽、S1、S基因和去除自身信号肽的S1及S基因;HBM与去除信号肽的S和S1基因进行融合,获得HBM-S1和HBM-S。HBM-S1、HBM-S及携带自身信号肽的S1、S基因经克隆鉴定正确后,亚克隆至pFastBacDual,经PCR、酶切和测序验证,表明获得携带HBM信号肽的S1和S基因和携带其自身信号肽S1和S基因的重组转座载体,分别转化DH1OBac,筛选获得融合HBM的重组杆粒rHBM-S、rHBM-S1及携带其自身信号肽的重组杆粒r-S和r-S1。三、将HBM-S1基因定向插入鉴定正确的pFast-HBM-N重组转座载体PH启动子下游,经PCR、酶切和测序鉴定,获得重组双元转座载体pFast-HBM-S1-N,转化DH10Bac转座后PCR鉴定获得纯化的共表达S1和N蛋白的重组杆粒rHBM-S1-N。本研究共构建六个重组杆状病毒的表达载体,为下一步单表达或共表达IBV的S1和N蛋白打下基础,为S和N蛋白生物学功能、病毒变异、致病机制、诊断抗原和新型疫苗的研究等奠定基础,也为研究HBM对IBV结构蛋白表达的影响提供证据。本研究的创新点是首次应用杆状病毒表达系统对IBV的主要保护性抗原S1蛋白和在细胞免疫中起重要作用且保守的N蛋白进行共表达研究,并且引入了昆虫细胞可识别的HBM信号肽,旨在使重组蛋白高效、分泌性表达且具有天然蛋白活性;为下一步高效新型基因工程疫苗和诊断抗原的研制奠定基础。
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