猪圆环病毒缺失突变体的构建及Cap蛋白的真核细胞重组表达

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猪圆环病毒2(PCV2)不仅引发猪圆环病毒相关疾病,还能与多种病原协同感染。PCV2感染相关的疾病有猪繁殖与呼吸道疾病综合症(PRRSV)、皮炎与肾病综合症(PDNS)、小肠炎、肺炎、仔猪先天性震颤等(CT),对养猪业造成了严重的经济损失。最近,PCV2感染猪群率不断上升,为了弄清病毒基因功能和特性,研制开发有效的基因工程疫苗或亚单位疫苗,本实验对PCV2的ORF2基因进行点缺失突变研究,并在杆状病毒表达系统中表达重组Cap蛋白。   以PCV2-HZ0201毒株为模板,采用DpnⅠ定点突变技术缺失,构建一系列ORF2基因编码区的单核苷酸突变体转染PK-15细胞,拯救病毒,结果表明,1057位点缺失的病毒拯救成功,拯救病毒毒价为10-5.32/0.1 mL,几乎和HZ0201毒株相等。而1375-1381、1503及1525位点的单核苷酸缺失突变体不能拯救出病毒,这些结果表明以上位点的核苷酸是PCV2复制必须的,而1057位点的核苷酸是PCV2复制非必须的。   通过PCR扩增PCV2的ORF2基因,插入转移载体pFastBac HTB,然后在Tn7转座子的作用下发生转座,通过蓝白斑筛选、质粒鉴定,构建出重组杆状病毒载体Bacmid-ORF2。重组质粒转染Sf9细胞,经IFA和Western blotting检测表明,Sf9细胞表达的Cap蛋白能与抗PCV2 Cap单克隆抗体发生特异性反应,表达产物的分子量约为30KD。电镜下观察显示,Sf9细胞表达的Cap蛋白可形成病毒样颗粒。这些数据表明,PCV2 Cap蛋白基因在Sf9细胞获得表达。  
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