骨软骨损伤通常由先天性畸形、交通意外或重度感染等原因引起。因为关节的机械不稳定性,关节损伤通常具有诱发骨关节退行性变性的风险。尽管再生医学领域已取得巨大进步,但由于骨和软骨具有不同的组织结构,修复骨软骨缺损仍然具有挑战性。利用组织工程技术通过移植骨软骨复合修复体可以克服复杂关节病变治疗中的限制,为骨软骨损伤修复带来希望。骨软骨组织工程技术就是利用种子细胞与携带生长因子的仿生支架相结合构建组织工程化骨软骨复合体,作为骨软骨缺损的移植材料来修复骨软骨损伤。近年来,水凝胶因具有与细胞外基质(ECM)相似的理化性质引起了极大的关注。天然聚合物水凝胶与其它合成生物材料相比,更接近活体组织,其具有较高的吸水率,吸水后可减少对周围组织的摩擦作用。同时水凝胶表现出良好的生物相容性,可以作为活性基质来控制细胞形态,增殖和分化。因此,水凝胶类生物材料在用于软组织再生方面具有较好的应用前景。本研究中,我们构建了一种双因子负载的双层骨软骨仿生支架,其软骨层由负载软骨诱导药物Kartogenin(KGN)的天然聚合物水凝胶构成,硬骨层由负载成骨诱导因子BMP-2衍生肽(P24肽)的合成聚合物纳米纤维支架构成。然后对所制备的双因子负载的双层复合支架的理化性能、生物相容性和体内外骨软骨修复能力等方面进行了一系列研究。主要从以下几个方面进行研究:(1)首先制备不同氧化葡聚糖含量的明胶/丝素/氧化葡聚糖水凝胶,探究氧化葡聚糖含量的改变对水凝胶理化性能的影响。实验结果表明,氧化葡聚糖的含量越高,水凝胶的孔径越小,溶胀性能越小,力学性能越高,降解速率越慢。这是因为氧化葡聚糖含量的增加提供了更多的醛基基团,使得席夫碱反应增强,交联度增加。(2)采用热致相分离(TIPS)技术制备聚左旋乳酸(PLLA)/聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)/聚己内酯(PCL)纳米纤维多孔支架,然后通过在支架表面涂覆聚多巴胺将P24肽固定在纳米纤维支架上。聚多巴胺的涂覆不仅可以促进P24肽的固定,同时还能极大地改善支架的亲水性,增强细胞对支架表面的亲和性。同时,综合考虑水凝胶的性能,我们选用6%的氧化葡聚糖配制水凝胶混合溶液。将之前制备好的纳米纤维多孔支架置于模具中,将水凝胶混合溶液浇铸在纳米纤维支架的上层,抽真空使部分水凝胶溶液浸入到纳米纤维支架的表层,然后常温交联成型得到双层骨软骨仿生支架。这种半嵌入式结合方法使得双层结构之间结合的更加紧密,不易分离。(3)对双因子负载的双层复合支架进行体内外生物学评价。细胞增殖实验表明,骨髓间充质干细胞(BMSCs)可以在双层骨软骨支架的软骨层和硬骨层上粘附和生长。细胞分化实验结果显示BMSCs在负载KGN的水凝胶支架上比未负载KGN的水凝胶支架上表现出更高的软骨相关标志物表达量。同样,BMSCs在负载P24肽的纳米纤维支架比未负载P24肽的纳米纤维支架表现出更高的碱性磷酸酶活性和更高的成骨相关标志物表达量。小鼠皮下包埋实验证明支架具有良好的生物相容性,细胞可以长入支架内部并且不会引起炎症反应。将双因子负载的双层复合支架植入兔膝关节骨软骨缺损模型中进行体内修复实验,结果发现双因子负载的双层复合支架组比空白对照组和无双因子负载的双层复合支架组的修复效果更好。综上所述,本研究制备的负载KGN和P24肽的双层复合支架可用于骨软骨损伤的修复。这种同时负载KGN和P24肽的双层复合支架为骨软骨损伤修复提供了新的治疗思路。