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肺癌是全球第一大致命的癌症,被人们称为“癌中之王”。根据病理类型,肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌占所有肺癌病例的85%以上。近几年来,非小细胞肺癌的发病率和死亡率不断增高。无论是在我国还是全球,非小细胞肺癌都已成为致死率最高的肿瘤。约75%的非小细胞肺癌患者确诊时已处于中晚期。而对于中晚期或已经转移的非小细胞肺癌患者,由于失去了手术治疗的最佳时机,系统性的化疗和放疗是最主要的治疗方法。然而放疗化疗耐药以及化疗药物诱导的DNA损伤和肝肾造血系统毒性等因素极大局限了现有治疗方案的效果,患者5年生存率很低。因此,筛选具有良好作用效果、副作用少、且耐药性小的抗非小细胞肺癌药物成为当前临床研究的热点和难点。研究人员在以Survivin基因作为靶标和生物标志物筛选抗癌药物时,发现了一种新型喜树碱类似物FL118。前期研究表明,FL118高效低毒抗耐药且抗瘤谱广,是一个很有临床应用价值的候选药物。然而,FL118对非小细胞肺癌的作用效果尚未明确。本课题旨在初步探究FL118对非小细胞肺癌的作用效果,促进FL118的进一步研究和开发,为非小细胞肺癌患者的临床用药提供新的选择。研究目的研究FL118对非小细胞肺癌A549细胞和H520细胞活力、凋亡、侵袭迁移能力和EMT过程的影响,为进一步深入探讨FL118抗非小细胞肺癌机制的研究提供理论依据。研究方法应用CCK-8实验方法,检测FL118对A549和H520细胞活力的影响;用倒置相差显微镜对加药处理的A549细胞和H520细胞进行拍照,观察其形态的改变;应用Western Blot、Hoechst-PI染色实验和Annexin V-FITC双染法流式细胞术实验检测FL118对A549和H520细胞凋亡作用的影响;采用Transwell实验以及划痕实验分别检测FL118对A549细胞和H520细胞迁移侵袭能力的影响;应用Western Blot实验及免疫荧光实验分别检测FL118对A549细胞和H520细胞EMT过程标志性蛋白E-cadherin和N-cadherin表达水平的影响以及E-cadherin和N-cadherin在细胞中的转运。研究结果(1)CCK-8实验显示,A549细胞和H520细胞经不同浓度的FL118(2 nM、5 nM、10 nM、20 nM、50 nM、100 nM和200 nM)处理24 h,100 nM FL118之前,其细胞活力基本无变化。当温育时间延长至48 h,随着药物浓度的升高,FL118能显著降低A549细胞和H520细胞的细胞活力,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性。形态学拍照的结果显示,不同浓度的FL118(2 nM、5 nM、10 nM和20 nM)处理A549细胞和H520细胞48 h,细胞逐渐呈现出不同程度的凋亡样特征。Western Blot的结果显示,促凋亡蛋白Bax和cleaved-PARP的表达水平随药物浓度的升高而上升,抗调亡蛋白Bcl-2及PARP的表达水平随药物浓度的升高而降低。Hoechst/PI双染法和Annexin V/PI双染法流式细胞术的实验结果进一步说明FL118可明显地诱导A549细胞发生凋亡,但对H520细胞的凋亡诱导作用较弱。在凋亡诱导效果上,两细胞存在敏感度差异。Annexin V/PI双染法流式细胞术实验中,在FL118的浓度为10 nM和20 nM时,A549细胞的平均凋亡率分别约为25%和35%,与对照组相比,均具有明显的统计学差异。在H520细胞中,相比对照组,FL118的浓度为10 nM时,平均凋亡率约为8%(相比于对照组没有统计学意义)。FL118的浓度为20 nM时,平均凋亡率约为10%(与对照度组比较,具有统计学差异)。(2)根据24 h的CCK-8实验结果,选取优化实验剂量(20 nM和50 nM)检测FL118对A549细胞和H520细胞侵袭迁移能力和EMT过程的影响。Transwell实验和划痕实验中,随着药物浓度的升高,FL118能逐渐降低A549细胞和H520细胞的侵袭迁移能力(与对照组比较,均具有明显的统计学意义)。细胞免疫荧光实验及Western Blot的实验结果显示,FL118可以明显促进E-cadherin的表达,抑制N-cadherin的表达,这表明FL118可明显抑制A549细胞和H520细胞的EMT过程。研究结论1.FL118在48 h时可显著降低A549细胞和H520细胞的细胞活力,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性。2.FL118在48 h时可明显地诱导A549细胞发生凋亡,但对H520细胞的凋亡诱导作用较弱。凋亡诱导效果上,两种细胞存在敏感度差异3.FL118在24 h时可明显降低A549细胞和H520细胞的侵袭迁移能力和抑制其EMT过程。