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背景与目的:胃癌(gastric cancer,GC)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤,位于全球第三大癌症死亡原因。胃癌具有发病隐匿和早期症状不明显等特点,多数患者首诊时疾病已进入进展期,且伴有淋巴结或远处器官的转移,这已成为胃癌防治的难点。因此,通过各种研究技术和手段深入研究胃癌发生、发展、转移以及耐药的分子机制,寻找早期诊断的分子标志物以及药物靶标已迫在眉睫。最近的研究表明,非编码RNAs参与了肿瘤转移和恶性转化的过程。MiR-4295是一个新发现的微小RNA(microRNA)分子,通过生物信息学分析,我们发现miR-4295与lncRNA HOTAIR存在结合位点。因此,我们的研究就从非编码RNAs入手,研究微小RNA(miR-4295)和长链非编码RNA(lncRNA HOTAIR)在胃癌生长增殖和侵袭迁移中的功能及其机制。第一部分miR-4295通过PTEN/PI3K/AKT通路调控胃癌生长和侵袭迁移的研究方法:本研究采用qRT-PCR检测胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和人胃粘膜上皮细胞系GES-1中及胃癌组织中miR-4295的表达情况。构建miR-4295真核质粒过表达载体及其抑制剂载体(miR-4295 inhibitor);采用瞬时转染法将构建好的载体转染至胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中,qRT-PCR检测转染细胞系中miR-4295的表达。CCK-8法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor及miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞增殖活力的影响;流式细胞术检测miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞凋亡率的影响;平板克隆法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor对胃癌细胞克隆能力的影响;划痕实验检测miR-4295和miR-4295 inhibitor对胃癌细胞迁移能力的影响;transwell法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor及miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞的侵袭迁移能力的影响。采用生物信息学软件miRanda、TargetScan、Pictar2、RNAhybrid、miRDB、RNA22-HAS、Targetminer、EMBL-EBI、miRWalk、DIANA-microT、mirbridge、miRNAMap和PITA在线预测miR-4295的靶基因。结合DAVID与KOBAS对miR-4295的靶基因进行GO分析及KEGG信号通路分析,分析miR-4295在胃癌细胞生物学过程中可能的分子机制。通过STRING在miR-4295的潜在靶基因中筛选出蛋白作用网络(protein-protein interaction,PPI)起关键作用的核心基因(hub gene)。通过TCGA数据库GEPIA对miR-4295靶向hub gene在胃癌中的相关性及其与胃癌患者的生存分析。利用qRT-PCR、Western blot检测miR-4295的靶基因及PI3K/AKT信号通路中相关基因的表达水平。最后采用双荧光素酶报告系统实验对miR-4295的靶基因进一步验证,明确目的miR-4295与其靶基因在胃癌中的关系。结果:1.胃癌细胞和组织中miR-4295表达水平检测。qRT-PCR结果显示(定量表达结果用Means±SD表示,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28分别为:1.832±0.120、2.421±0.187、1.328±0.102、1.000±0.040),与人胃粘膜上皮细胞系GES-1(0.962±0.070)比较,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28胃癌细胞系miR-4295表达水平均升高,以SGC-7901、MGC-803表达水平升高最为显著;31例胃癌患者中,与正常胃粘膜组织相比,胃癌组织中miR-4295表达显著上调80.6%(25/31);miR-4295的表达水平与胃癌的肿瘤大小及远端转移相关具有显著性(p<0.05),而与胃癌患者的年龄、性别、组织学分级及淋巴结转移无显著相关性(p>0.05)。2.构建miR-4295过表达质粒载体和和miR-4295 inhibitor质粒载体。测序结果显示,重组的miR-4295及其inhibitor序列插入准确无误,说明重组的miR-4295和miR-4295 inhibitor质粒载体构建成功。qRT-PCR检测转染胃癌细胞中miR-4295的表达水平,结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达水平显著上调(p<0.05);miR-4295inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达水平显著下调(p<0.05)。3.CCK-8法检测转染后胃癌细胞增殖活力。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显著增加(p<0.05);miR-4295 inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显著降低(p<0.05);相较于miR-4295转染组,miR-4295联合AKT抑制剂组细胞增殖活力显著降低(p<0.05)。4.流式细胞术检测miR-4295联合AKT抑制剂处理胃癌细胞后的凋亡率。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的凋亡率显著降低(p<0.05);相较于miR-4295转染组,miR-4295联合AKT抑制剂处理的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的凋亡率显著增加(p<0.05)。5.平板克隆形成实验检测转染后胃癌细胞的克隆能力。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的克隆数量显著增加(p<0.05);miR-4295 inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的克隆数量显著减少(p<0.05)。6.划痕实验检测转染后对胃癌细胞迁移的影响。划痕实验结果显示:上调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于miR-NC组,miR-4295组细胞迁移间距小(p<0.05);而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于Anti-miR-NC组,miR-4295 inhibitor组细胞迁移间距大(p<0.05)。7.Transwell实验检测转染后对胃癌细胞迁移、侵袭的影响。结果显示:相较于miR-NC组,miR-4295组细胞迁移和侵袭数显著增加(p<0.05);而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,相较于Anti-miR-NC组,miR-4295 inhibitor组细胞迁移和侵袭数显著减少(p<0.05);相较于miR-4295,miR-4295联合AKT inhibitor组细胞迁移和侵袭数显著减少(p<0.05)。8.miR-4295的潜在功能及其机制。通过14个预测软件,结果共筛选出15353个miR-4295候选靶基因。选取同时由7个生物软件预测阳性结果,共选出600个miR-4295靶基因进行后续GO、pathway分析及靶基因分子网络分析。GO功能富集分析,结果显示24条信号通路显著富集于生物学过程中(p<0.01);12条信号通路显著富集于细胞组成中(p<0.01);12条信号通路显著富集于细胞组成中(p<0.01)。KEGG信号通路分析,结果显示miR-4295靶基因显著富集于23条信号通路信息(p<0.01)。miR-4295靶基因蛋白互作(PPI)网络,共筛出15个hub genes,包括CUL3、PPARG、UBE2D1、FMR1、SUV39H1、RAB5A、AGO4、RNF2、PTEN、RUNX2、KMT2A、ITPKB、ESR1、DICER1和LDLR。miR-4295 hub gene PTEN与BCL2L11具有显著相关性。利用生物信息学软件预测miR-4295与PTEN及BCL2L11 3’UTR靶位点情况,结果显示:PTEN 3’UTR靶位点位于其3’UTR 412-418 bp,序列(5’-3’)为UUGCACU;BCL2L11 3’UTR靶位点位于其3’UTR4093-4099 bp,序列(5’-3’)为UUGCACU。PTEN 3’UTR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的PTEN 3’UTR及其突变体序列插入准确无误,说明psiCHECK2-PTEN-3’UTR与psiCHECK2-PTEN-mut-3’UTR重组质粒构建成功;BCL2L11 3’UTR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的BCL2L11 3’UTR及其突变体序列插入准确无误,说明GV272-BCL2L11-3’UTR与GV272-BCL2L11-mut-3’UTR重组质粒构建成功。双荧光素酶活性检测结果显示:相较于PTEN-3’UTR+miRNA-NC共转染组,PTEN 3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显著降低,说明miR-4295能够结合PTEN 3’UTR,抑制其表达;PTEN-3’UTR+miRNA-NC共转染组与PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显著性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的PTEN 3’UTR结合,不能抑制其表达;PTEN3’UTR+miR-4295共转染组与PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显著增加,进一步说明PTEN 3’UTR靶位点突变后,miR-4295不能与其结合,进而不能抑制靶基因表达。以上结果说明miR-4295能够直接结合靶基因PTEN 3’UTR并抑制其表达。相较于BCL2L11-3’UTR+miRNA-NC共转染组,BCL2L11 3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显著降低,说明miR-4295能够结合BCL2L11 3’UTR,抑制其表达;BCL2L11-3’UTR+miRNA-NC共转染组与BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显著性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的BCL2L11 3’UTR结合,不能抑制其表达;BCL2L11 3’UTR+miR-4295共转染组与BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显著增加,进一步说明BCL2L11 3’UTR靶位点突变后,miR-4295不能与其结合,进而不能抑制靶基因表达。以上结果说明miR-4295能够直接结合靶基因BCL2L11 3’UTR并抑制其表达。采用qRT-PCR检测miR-4295对胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中靶基因及其相关基因mRNA表达的影响。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染组中PTEN、BCL2L11基因mRNA的水平显著降低(p<0.05),而PI3K、AKT、mTOR基因mRNA表达水平无显著性差异;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染组中PTEN、BCL2L11基因mRNA的水平显著增加(p<0.05),而PI3K、AKT、mTOR基因mRNA表达水平无显著性差异。采用Western blot检测miR-4295对胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中靶基因PTEN、BCL2L11及其相关蛋白表达水平的影响。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染组中PTEN、BCL2L11蛋白的水平显著降低,而PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著增加(p<0.05);而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染组中PTEN、BCL2L11蛋白的水平显著上调,而PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著降低(p<0.05)。第二部分lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究方法:本研究采用qRT-PCR检测胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和人胃粘膜上皮细胞系GES-1中HOTAIR的表达情况。通过基于TCGA与GTEx公共数据库的GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)分析HOTAIR在408例胃癌中的表达水平。化学合成siHOTAIR,采用瞬时转染法将构建好的siHOTAIR转染至胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中,qRT-PCR检测转染细胞系中HOTAIR的表达;CCK-8法检测siHOTAIR对胃癌细胞增殖活力的影响;划痕实验检测siHOTAIR对胃癌细胞迁移能力的影响;transwell法检测siHOTAIR对胃癌细胞的侵袭迁移能力的影响。利用信息学软件UCSC(Version 2009)和StarBase v2.0预测miR-4295与HOTAIR的结合位点;采用双荧光素酶报告基因系统实验检测验证miR-4295与HOTAIR的位点结合情况。结果:1.胃癌细胞系(SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28)分别进行HOTAIR表达水平分析。qRT-PCR检测结果显示(定量表达结果用Means±SD表示,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28分别为:1.000±0.1000、0.370±0.040、0.280±0.030、0.310±0.040),与人胃粘膜上皮细胞系GES-1(0.190±0.070)比较,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28胃癌细胞系HOTAIR表达水平均升高。以SGC-7901、MGC-803表达水平升高最为显著。利用GEPIA分析HOTAIR在胃癌组织中的表达比正常胃粘膜组织中的表达显著升高。2.将siHOTAIR与siNC分别瞬时转染胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803。转染48 h后,采用qRT-PCR法检测HOTAIR的表达水平。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中HOTAIR的表达水平显著下调(p<0.05)。3.CCK-8法检测转染后胃癌细胞增殖活力。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显著降低(p<0.05)。4.划痕实验检测转染后对胃癌细胞迁移的影响。划痕实验结果显示:下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中HOTAIR的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组细胞迁移间距大(p<0.05)。5.Transwell实验检测转染后对胃癌细胞迁移、侵袭的影响。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组细胞迁移和侵袭数显著减少(p<0.05)。6.StarBase v2.0 software预测miR-4295与HOTAIR位点结合情况,结果显示,HOTAIR结合位点序列(5’-3’)为UUGCACU。HOTAIR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的HOTAIR及其突变体序列插入准确无误,说明psiCHECK2-HOTAIR与psiCHECK2-HOTAIR-mut重组质粒构建成功。双荧光素酶活性检测结果显示:相较于HOTAIR+miR-NC共转染组,HOTAIR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显著降低,且差异具有统计学意义,说明miR-4295能够结合HOTAIR;HOTAIR mut+miR-NC共转染组与HOTAIR mut+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显著性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的HOTAIR结合。以上结果说明miR-4295能够直接结合HOTAIR。结论:1.miR-4295、HOTAIR在胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和胃癌组织中均高表达,miR-4295的表达水平与胃癌的肿瘤体积大小及远端转移呈正相关。2.miR-4295可促进胃癌细胞的生长增殖和侵袭迁移,而下调miR-4295的表达可抑制胃癌细胞的生长增殖和侵袭迁移;miR-4295联合AKT抑制剂能够降低胃癌细胞的增殖和侵袭迁移能力,增加胃癌细胞凋亡率。3.PTEN、BCL2L11是miR-4295的直接靶基因;上调胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著增加;下调胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著降低。4.下调HOTAIR可抑制胃癌细胞增殖和侵袭迁移,且发现miR-4295与HOTAIR存在结合位点。