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在有花植物受精过程中,具有顶端极性生长特性的花粉管是雄性生殖单位的载体,同时也是研究细胞生长分子调控机理的理想体系。与被子植物相比,裸子植物花粉具有萌发时间长、花粉管生长缓慢等特点。对于裸子植物花粉萌发和花粉管生长的机理,目前人们尚不十分清楚。本文将以裸子植物白杆(Piceameyeri)花粉为材料,应用不同浓度的分泌系统干扰剂Brefeldin A处理,并通过细胞学和生理生化方法,其中包括普通光学显微镜、荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、显微红外光谱(FTIR)和透射电镜(TEM)等技术,对其花粉萌发和花粉管生长过程中胞吞胞吐的调控,以及与细胞壁建成的关系等进行较为系统的研究,旨在为进一步揭示裸子植物花粉管发育的调控机理提供参考。
首先比较观察了各种细胞器在白杆与被子植物花粉管中的分布差异。经FM4-64探针标记结果表明,在正常生长的白杆花粉管顶端存在分泌小泡积累的透明区,但与被子植物比较起来,此透明区在花粉管中所占比例较小,且不呈倒“V”字型。在透射电镜下观察发现,其花粉管顶端透明区内分泌小泡的分布密度远低于被子植物。另外,在白杆花粉管中,线粒体的分布一般靠近细胞壁的地方,高尔基体分布较为分散,而内质网的分布则不具方向性。
其次,研究了BFA对白杆花粉萌发和花粉管生长的影响,特别是对其花粉管生长过程中的胞吐/胞吞作用。通常在正常生长的白杆花粉管中,用FM4-64标记后发现,在其顶端形成与透明区对应的荧光亮区;超微结构显示,在花粉管顶端进行旺盛的胞吐作用,许多分泌小泡正与质膜融合,以及分布有大量显示高分泌活性的壁旁体(PB)等。而经过BFA处理后,花粉的萌发和花粉管的生长均受到严重抑制,花粉管出现了弯曲(波状生长)或顶端膨大等异常形态,同时还干扰了FM4-64在花粉管顶端的标记模式。另外,花粉管顶端分泌小泡数量减少,透明区内充满线粒体、高尔基体和空泡等一些大的细胞器,壁旁体也随之消失,其中高尔基体呈现解体或弯曲的异常形态,在其周围的分泌小泡数量大大减少,内质网出现膨胀和核糖体脱落等;同时胞吐活性标志性酶——酸性磷酸酶的活性也随之降低。通过对FM4-64的染料吸收实验表明,BFA对胞吞有明显的促进作用。由上可见,BFA对白杆花粉管生长过程中的胞吐和胞吞作用起了相反的影响, BFA正是通过扰乱花粉管生长过程中的分泌途径来抑制其花粉管的生长。
最后,检测了白杆花粉管分泌途径紊乱后,管壁物质合成的变化情况。通过FTIR光谱分析表明,BFA处理后花粉管壁化学组分发生了变化,例如蛋白质和多糖含量明显减少,而且与蛋白比较起来,多糖的含量下降更为明显,尤其是在顶端。蛋白和多糖含量的下降导致花粉管壁的组成结构不够致密。由SDS-PAGE的结果显示, BFA抑制后,花粉管壁中糖蛋白的含量下降了60%,同时很多壁蛋白条带在BFA处理后不表达或含量减少。通过对花粉管壁多糖成分的研究表明,BFA处理还导致纤维素含量下降,而胼胝质在花粉管顶端积累。用识别AGPs的LM6和识别酸性果胶的JIM5对花粉管进行标记,发现BFA处理后AGPs的环状分布消失,酸性果胶质在顶端的含量也明显减少,但在胞质内却形成一些小的分隔亮点(compartments)。
综上所述,导致裸子植物白杆花粉管生长缓慢的原因,可能与其顶端透明区较小、分泌小泡数量少等有关。另外,从白杆花粉管的细胞质状态和细胞器分布上看,虽然与被子植物相比差异较大,但在其正常生长中仍能进行旺盛地胞吐和胞吞过程。经BFA处理后引起花粉管内分泌系统的紊乱,致使管壁物质不能正常合成,从而导致花粉管的停滞生长。