人体蠕形螨,属节肢动物门,蠕形螨科,俗称毛囊虫(follicle mites),分为毛囊蠕形螨(Demodex folliculorum)和皮脂蠕形螨(Demodex brevis)两种,分别寄生于人体毛囊和皮脂腺内。可引起人体蠕形螨病,表现为皮肤粗糙、毛孔扩张、毛囊炎、皮脂腺囊肿、脱发等症状。最早在哺乳期,婴儿即可从母体感染蠕形螨。世界各地均有蠕形螨病病例报道,蠕形螨病主要通过接触传播,呈世界性分布。近十几年蠕形螨病的研究受到关注,逐渐成为人体寄生虫学及皮肤病学领域的热门课题。从目前参考文献看,对人体蠕形螨的研究不多,主要集中在形态学和临床治疗方面,国内对蠕形螨的研究在数量、深度和广度方面均已超过国外,但有关人体蠕形螨病的研究仍处于起步阶段。因观察到蠕形螨的诸多体表锐性结构,蠕形螨机械致病学说得到公认,但对其化学致病和免疫致病机制仍不清楚。临床医生对蠕形螨病尚停留在对症治疗阶段。蠕形螨分子生物学研究刚刚起步,有报道已成功提取到了蠕形螨RNA、DNA,建立了其cDNA文库,但对蠕形螨基因功能和基因表达的研究还处于空白阶段。蠕形螨分子生物学研究滞后的主要原因是,蠕形螨形体微小,需要用专门的工具和技术收集处理标本,缺乏成熟的提取蠕形螨基因和蛋白质的实验技术也成为阻碍研究进展的技术瓶颈。我们研究团队经多年的努力成功解决了上述技术难题。另外人体蠕形螨实验标本局限于从志愿者身上获取,不能人工培养,我们课题组用分子遗传学方法证明山羊蠕形螨与皮脂蠕形螨之间的遗传距离较毛囊蠕形螨与皮脂蠕形螨之间的遗传距离更近,理论上山羊蠕形螨是研究两种人体蠕形螨的理想动物模型。蛋白质是生命活动主要实施者,通过解读蛋白质来研究生物的特征,掀开了生命科学研究的新篇章。从蛋白质组学的角度出发,了解蠕形螨的生理代谢和致病机理是一种全新而根本的途径。目的 蠕形螨蛋白质方面的研究还未见报道,本实验试图探索蠕形螨全蛋白的提取方法,并初步分离、鉴定和分析蠕形螨蛋白质组分。为进一步从蛋白组学的角度探索蠕形螨蛋白的结构、功能和致病性做基础铺垫。为建立蠕形螨蛋白质组数据库增添重要信息。方法从波尔山羊的新鲜皮肤结节中收集山羊蠕形螨样本。准备消毒实验器具,制备试液。在剥离面用手术刀切开羊皮结节,将其内干酪样物(0.5g)转移至特制的微型水晶研钵内,加入相同体积的洗洁精原液,用自制研磨棒将混合物充分研磨至均匀乳液状,再将其转移到15 ml玻璃试管中,加入8 ml PBS进行稀释,用玻璃材质皮试注射器吹打混匀。20℃,自然沉淀1 h,吸除上清液,重复上述步骤3次。再将清洗沉淀物转移至1.5ml EP管中,8,000 rpm离心20 min,弃上清液即得实验样本。称重等分样本,分装于EP管中,-80℃冷冻保存备用。分别用液氮研磨法和机械匀浆法破碎蠕形螨样本,每种又分别使用RIPA裂解液和自制裂解液裂解,得到四种裂解样本。13,000 rpm离心60 min,取上清液,置于EP管中,-20℃冷冻保存备用。用非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒,检测提取蠕形螨蛋白的浓度。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析比较提取蠕形螨蛋白的效果。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定部分蛋白质条带。根据Mascot检索软件检索NCBI数据库,对山羊蠕形螨蛋白组分进行初步分析。结果本实验成功提取了山羊蠕形螨全蛋白。实验发现,液氮研磨法破碎螨体的效果较机械匀浆法好。用自制裂解液裂解蠕形螨组织细胞的效果较传统的RIPA裂解液效果好,前者裂解出的蠕形螨蛋白浓度高,提取到的蛋白质较全,经SDS-PAGE分离蛋白可见蛋白条带多且清晰。用液氮研磨法加自制裂解液裂解样本,提取螨形螨蛋白效果最佳。MALDI-TOF-MS鉴定部分蛋白条带,检索蛛形纲蛋白数据库比对出了21种可信蛋白,170 kD的蛋白为胞质肌动蛋白,130 kD的蛋白为腺苷酰转移酶和谷氨酰胺连接酶,15 kD以下蛋白大部分为组蛋白。70 kD和15 kD蛋白与相近物种蛋白数据库比对没有对应的可信蛋白,本实验是首次提取蠕形螨蛋白,没有蠕形螨蛋白质专有数据库,因此分子量位于70 kD和15 kD的蛋白也可能是蠕形螨的专有蛋白。结论用液氮研磨法加自制裂解液裂解蠕形螨样本效果最佳,本实验成功提取到了山羊蠕形螨全蛋白。采用以蛋白分子量不同为原理的SDS-PAGE电泳和以蛋白质等电点、分子量差异为原理的双向电泳,分离了蠕形螨全蛋白。用MALDI-TOF-MS分析鉴定了蠕形螨蛋白质组分。为开展蠕形螨蛋白质组学研究,探索蠕形螨的功能蛋白及化学致病机制提供了参考。